陈军正式答辩1.ppt

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1、沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究答辩人：陈军导师：张丽芳教授姜丽萍教授专业：病原生物学2008.5.17Contents背景1目的2方案与结果3讨论与分析4汇报内容5结论Diagram2007200620052004沙眼衣原体（Ct）,最常见的性传播疾病(STDs)病原体之一,与不良妊娠有关。有多种血清型。E型——我国最常见。D型——全球流行最广泛。全世界,8900万/年泌尿生殖道感者。治疗后易复发，治疗成本较高长期反复感染易遗留不可逆的病理变化背景迫切需要沙眼衣原体疫苗的问世！迫切需要准确的实验室诊断筛选方法！背景Ct的疫

2、苗研制现状：灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、抗独特型疫苗、树突状细胞疫苗。沙眼衣原体主要外膜蛋白（MOMP）成为Ct疫苗研究的靶抗原。用MOMP全序列免疫时存在病理免疫问题。关于Ct的T细胞表位研究较多，B表位的研究报道较少。背景Ct的实验诊断技术研究现状◆细胞生物学方法◆免疫学方法◆分子生物学方法目的1.预测Ｅ血清型CtMOMPB细胞表位2.构建B细胞表位基因的原核重组质粒3.获得B细胞表位融合蛋白4.检测B细胞表位融合蛋白的免疫原性研究方案预测B细胞表位构建重组质粒原核表达及纯化重组蛋白检测免疫原性预测B细胞表位1．Ct主要外膜

3、蛋白氨基酸序列：检索自瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白质数据库。2．多种方法预测E血清型Ct主要外膜蛋白B表位3.B表位筛选：用抗原性指数(AI)综合评判CtMOMP的B细胞优势表位。GOR——MOMP的二级结构人工神经网络资源——跨膜区域Hopp-Woods——亲水性Janin——可及性参数Emini——表面可能性Jameson-Wolf——抗原性预测结果表2CtMOMP的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数(AI)B-cellepitopesDominantregionsofAminoacidsequenceAI73~81VLKTDVN

4、KE0.045161~175DNENQSTVKTNSVPN0.033217~225QSKPKVEEL0.043261~270TKDASIDYHE0.037377~386TRLIDERAAH0.038P1P2P5P6P7P8构建重组质粒引物设计与合成退火获得目的基因pET32a(+)/CtMOMPB细胞表位重组质粒的构建纯化、连接、转化DH5α大肠杆菌pET32a(+)质粒酶切酶切、测序鉴定pET32a(+)/CtMOMPB细胞表位引物设计引物碱基序列酶切位点P15‘GATCCGTTTTGAAAACAGATGTGAATAAAGAAC3’(BamHI)P

5、25‘TCGAGTTCTTTATTCACATCTGTTTTCAAAACG3’(XhoI)P55‘GATCCACTCGCCTGATTGATGAGCGCGCTGCTCACC3’(BamHI)P65‘TCGAGGTGAGCAGCGCGCTCATCAATCAGGCGAGTG3’(XhoI)P75‘GATCCACTAAAGATGCCTCTATTGATTACCATGAGC3’(BamHI)P85‘TCGAGCTCATGGTAATCAATAGAGGCATCTTTAGTG3’(XhoI)pET32a(+)/CtMOMPB细胞表位重组质粒图pET32a(+)/CtMO

6、MPB细胞表位重组质粒酶切鉴定图bp65574361252212345bp655743612522bp655743612522（A）P1P2；（B）P5P6；（C）P7P81:pET32a(+)/EcoRI;2:pET32a(+);3:重组质粒/EcoRI：4:重组质粒；5:λDNA/HindⅢ分子标准物（A）（B）（C）测序鉴定表达及纯化融合蛋白将重组质粒转化入BL21大肠杆菌摸索最佳表达条件、诱导表达高浓度的表位融合蛋白亲和层析法纯化目的蛋白SDS-PAGE、Westernblot分析Mr(kD)5131251512345pET32a(+)/Ct

7、MOMPB细胞表位融合蛋白鉴定图10B细胞表位融合蛋白表达产物SDS-PAGE(A）及WesternBlot分析（B）1～3:IPTG诱导重组质粒蛋白表达4:IPTG诱导空载体pET32a(+)蛋白表达；5：蛋白分子标准物Mr(kD)105795131251512345（A）（B）纯化结果Mr(kD)7951312515Mr(kD)51312515图11纯化后的融合蛋白SDS-PAGE及WesternBlot分析1：纯化的His蛋白；2：纯化的P5P6蛋白；3：纯化的P7P8蛋白；4：纯化的P1P2蛋白；5：分子标准物；1234512345免疫原性检

8、测动物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多点注射血清标本采集：尾静脉采血，收集血清-20℃保存组别