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1、荧光分析法测定维生素C维生素C及维生素C的测定原理荧光分析法测定维生素C实验荧光分析法测定维生素C讲解人：贺政轩一、维生素C及维生素的测定原理1.1维生素C维生素C又名抗坏血酸,是维持机体正常生理功能的重要维生素之一,而人体不能自身合成，只能从食物和药物中摄取，因此，食品、药物中维生素C的分析具有重要意义。1.2维生素C测定方法维生素C的测定常用的方法有光度法、电化学法、滴定法、酶法、色谱法等。本实验提出了一种新的测定维生素C的荧光分析方法：维生素C被Cu2+氧化为脱氢抗坏血酸，再与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用，通过对体系
2、荧光强度的测定进行维生素C的定量分析。二、荧光分析法测定维生素C实验1实验1.1主要仪器与试剂分子发光仪:LS-55型酸度计:pH-211型榨汁机:CW-JE04型电热恒温水浴锅:HH.SY11-Ni1型CuSO4溶液:2.0×10-3gm/L十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液:6.0×10-4g/mL苯甲酸溶液：1.0×10-4gm/L维生素C标准储备液:5.0×10-4g/mL,2～8℃（避光保存）；维生素C标准溶液:1.0×10-5g/mL,2～8℃（避光保存）；NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液:pH=6.0；1.2实验步骤（1）配
3、置待测样品及空白对照在25mL比色管中依次加入0.6mLCuSO4溶液，2.0mL十六烷基三甲基溴化铵溶液，2.0mL苯甲酸溶液，一定体积的维生素C标准溶液，5.0mLNaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液,用蒸馏水定容，摇匀；以不含维生素C溶液为空白对照。（2）水浴加热在35℃恒温水浴中加热30min，将溶液流水冷却至室温。（3）荧光分析将待测样品放置于样品架上，设定激发波长为308nm，发射波长为408nm，测量荧光强度F，以不含维生素C的试剂空白为F0，计算F测=F-F0。2结果与讨论2.1激发光谱和发射光谱取3.0mL维生素C标准溶液,按实
4、验方法进行操作,分别在290～330nm、360～460nm内扫描得到激发光谱和发射光谱如图1、图2所示。从图1、图2中可看出,当激发波长为308nm,发射波长为408nm时体系的荧光强度最大,试剂空白的荧光值比较低且稳定,故本实验选择激发波长为308nm,发射波长为408nm。1—Cu2++BA+缓冲溶液+CTMAB;2—Cu2++BA+维生素C+缓冲溶液+CTMAB1—Cu2++BA+缓冲溶液+CTMAB;2—Cu2++BA+维生素C+缓冲溶液+CTMAB激发光谱发射光谱2.2试剂加入顺序按照实验方法操作,在各试剂加入量相同的情况下,试验
5、了试剂的不同加入顺序对荧光强度的影响。试验结果表明,当所加试剂顺序依次为CuSO4溶液、苯甲酸溶液、维生素C标准溶液、NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液时,体系的荧光强度最大，因此选用此加入顺序为最佳试剂加入顺序。2.3缓冲溶液溶液的pH值对体系荧光强度有较大的影响，试验了不同的pH值对荧光强度的影响。由pH值—荧光强度的曲线可知,当pH值为5.9～6.2时,荧光强度达到最大值且比较稳定,因此确定最佳pH值为6.0。缓冲溶液的种类对体系的荧光强度也有一定的影响。试验了以下几种pH值为6.0的缓冲溶液:NaOH-KH2PO4、KH2PO4-硼砂、
6、KH2PO4-Na2HPO4、NaOH-邻苯二甲酸氢钾、Na2HPO4-柠檬酸、NaOH-柠檬酸钠、HAc-NaAc等。试验结果表明,当所加的缓冲溶液为NaOH-邻苯二甲酸氢钾时,荧光强度最大且稳定。因此本实验选择NaOH-邻苯二甲酸氢钾为缓冲溶液,其最佳用量为5.0mL。2.4加热温度和加热时间试验了不同温度对体系荧光强度的影响。结果表明,当加热温度为35℃时，既有利于提高体系反应速度，又不使反应物与产物结构受到破坏。改变加热时间进行试验,结果发现，在35℃水浴中加热30min，体系荧光强度达到最大值且相对稳定。2.5硫酸铜和苯甲酸的用量其
7、它条件不变，试验了硫酸铜和苯甲酸的用量对体系荧光强度的影响。结果表明，当硫酸铜的用量为0.6mL、苯甲酸的用量为2.0mL时，体系荧光强度最大。2.6表面活性剂分别试验了十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、十二烷基磺酸钠及β-环糊精对体系荧光强度的影响。结果表明,表面活性剂对体系的荧光强度有一定的增敏效果，其中CTMAB对体系的增敏效果最好。进一步试验了CTMAB的用量对体系的荧光强度的影响,当CTMAB的用量为2.0mL时,体系荧光强度最大。三、荧光分析法测定维生素C应用样品测定取一片维生素C药片，研细，混匀，准确称取0.1520g溶于二次
8、蒸馏水中，转移至500mL容量瓶中定容，配成水溶液。再准确移取10mL此溶液，将其稀释成100mL的溶液，作为样品稀释液。对样品稀释液进行测定并做加标回收试验。同时
