PCR污染的产生及防治.doc

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1、PCR污染的产生及防治一．引起PCR污染的原因由于PCR产物和克隆质粒的拷贝量很大，所以显著的PCR污染都是由PCR产物和克隆质粒的污染造成的。引起PCR污染有三种原因：①实验室空间污染(气溶胶污染)；气溶胶：悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm～100μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态分散体系。空气与液面摩擦时就可形成气溶胶：在操作时比较剧烈地摇动反应管；开盖时、吸样时及移液枪的反复吸样，都会形成气溶胶。PCR产物和克隆质粒的气溶胶污染：据计算一个气溶胶颗粒可含上万个拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

2、携带克隆质粒的微生物或病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散。②PCR试剂相关组分污染；PCR试剂的相关组分被核酸污染。③操作时加样交叉污染；1）容器被污染；2）样本核酸模板在提取过程中，由于移液枪污染导致样本间污染；3）有些微生物样本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染；4）模板吸取过程中，因气溶胶或其他原因引起移液枪污染，从而导致交叉污染。二．PCR污染的监测对PCR污染的监测是通过设置对照试验来实现的。1.阳性对照：采用重组质粒和阳性样本，考察PCR反应是否成功，以及PCR产物位置和大小是否合乎理论注意：重

3、组质粒和阳性样本对待扩增样品可能会造成污染，操作时需注意防止交叉污染。2.空白对照：PCR试剂中不加DNA模板，考察PCR试剂是否被污染三．PCR污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低或杜绝可能出现的PCR污染。主要涉及：1）划分操作区理想的PCR实验室分区：2）分装试剂PCR用水为无菌水或高压的双蒸水。PCR扩增所需试剂均应在无PCR扩增产物区配置。引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。所用的移液枪不能用来吸取PCR产物或其他DNA。3）实验操作的注意事项1

4、.在准备样品时，穿戴清洁的工作服和手套，切忌穿戴已污染过PCR产物的工作服和手套；2.准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起；3.模板在加酶前最后一个加；4.开管动作要轻，以防管内液体溅出。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并于稀酸擦拭桌面。所有含质粒模板和PCR产物的EP管开盖前高速离心1-3分钟；5.标本制备区，试剂准备区和产物分析区的移液枪不能混用，因为移液枪最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染；6.对于试剂配置区，禁止带入PCR产物，禁止操作质粒和含克隆质粒的菌液；7.PCR反应完成后，尽

5、量减少打开密封反应体系的机会；如必须打开，应在产物分析区再打开；8.实验结束后或定期清洁工作台面和仪器。四．PCR污染的处理1.反应液污染向反应液中加入UNG（Unacil-N-Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基酶），50摄氏度处理2分钟。UNG作用于含有dU的DNA双链或单链，有助于消除反应液中的DNA污染。对于UNG处理DNA的效率，DNA片段越长，处理效率越高。小于100bp的产物，效果不很完全。在PCR反应的预变性阶段，UNG会失活。2.环境污染1）紫外照射法（254nm或300nm）紫外光照射30分钟即可。紫外

6、光照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。PS：紫外灯的常见波长为254nm，300nm和365nm2）稀酸处理法对可疑器具用1mol/L的盐酸擦拭或浸泡，使得残余DNA脱嘌呤。