环孢素a血药浓度hplc测定方法

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1、环孢素A血药浓度HPLC测定方法　　【摘要】目的：建立环孢素A血药浓度的HPLC测定方法。方法：采用反相HPLC的方法，血样经乙醚萃取，正己烷洗脱等处理后测定。采用DiamonsilTMC18色谱柱，流动相为乙腈-水（74：26，V/V），流速为1ml/min，柱温为70℃，检测波长为210nm。结果：环孢素A血药浓度在50～1000ng/ml范围内线性关系良好，R2=0.9997，低中高三种浓度的提取回收率为70.01%～75.00%，方法回收率为98.93%～103.08%，日内精密度RSD为0.84%～4.

2、76%，日间精密度RSD为5.38%～9.87%。结论：该方法快速灵敏准确，可用于环孢素A血药浓度的监测。【关键词】环孢素A；高效液相色谱；血药浓度监测环孢素A（CyclosporineA，CsA）是一种强效免疫抑制剂，目前广泛用于器官和组织移植术后的预防和治疗[1]。然而CsA治疗的有效血药浓度范围为100～450μg/L，600μg/L以上即有中毒危险[2]，特别是肝肾毒性明显[3]。CsA治疗窗窄，个体差异大，因此，临床应用必须监测其血药浓度。本实验建立了一种简单准确的HPLC测定CsA血药浓度的方法，现报

3、告如下。1材料与方法1.1仪器与试剂CsA6标准品，乙醚，正己烷，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），Agilent1200型高效液相色谱仪，DiamonsilTMC18色谱柱，GENIUS6K-D离心机，XW-80A漩涡混合仪。1.2标准溶液的配制精密称取CsA标准品10.006mg置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作为CsA标准品储备（100μg/mL）。用甲醇稀释，分别配成2.5、5、10、25、50μg/ml的CsA标准品溶液。1.3样品的处理1.3.1空白血样取人全血1～10ml均塞离心管中，加入1m

4、l0.1mol/L的NaOH溶液，涡旋2min，加入5ml乙醚，涡旋5min，3500r/min离心10min，取上清液4.5ml，40℃水浴吹干，加入100μl甲醇-0.05mol/ml盐酸（1：1，V：V）的混合液[4]，涡旋30s，加入250μl正己烷，涡旋2min，3500r/min离心5min，弃去正己烷，取下层溶液进样。1.3.2加药血样取浓度为2.5、5、10、25、50μg/mL的CsA标准溶液各20μl置10ml均塞离心管中，分别加入人全血1ml，配置成含CsA50、100、200、500、10

5、00ng/ml血液样品，加入1ml0.1mol/L的NaOH溶液，后处理方法同“1.3.1”项下空白血样。1.4色谱条件的选择色谱柱：DiamonsilTM6C18（4.6×200mm，5μm）；流动相：乙腈-水（74：26）；流速：1ml/min；柱温：70℃；检测波长：210nm；进样量：20μl。1.5方法专属性在上述色谱条件下，分别取CsA标准液，空白血样，加药血样进行HPLC测定，考察其色谱图。1.6标准曲线的制备取血药浓度为50、100、200、500、1000ng/ml加药样品进行HPLC测定，以药

6、物浓度C与样品峰（A）做线性回归，制备标准曲线。1.7回收率配制浓度分别为50、200、1000ng/ml的加药血样，按照“1.3.1”项下的处理方法处理、测定，分别与同浓度的CsA标准溶液直接进样的峰面积做比较，计算提取回收率即绝对回收率。配制浓度分别为50、200、1000ng/ml的加药血样，按照“1.3.1”项下的处理方法处理、测定，按：“方法回收率=测得量/理论值×100%”计算方法回收率即相对回收率。1.8精密度浓度分别为50、200和1000ng/ml的加药血样按照“1.3.1”项下的处理方法处理，

7、测定，一日内重复操作5次，考察其日内精密度。在随后的5d内，重复操作5次，考察其日间精密度。2结果2.1方法专属性CsA色谱图考察结果如图1所示，可见CsA的保留时间为7.66min左右，空白血样在此时间点无干扰，CsA与血液中的内源性物质分离良好。2.2标准曲线及线性范围结果如图2所示，所得标准曲线为：A=0.0983C-1.629，R2=0.9997。2.3回收率低、中、高浓度的加药血样的提取与方法回收率见表1。低、中、高浓度的加药血样的日内与日间精密度见表2。3讨论个体化给药是临床用药的发展趋势，血药浓度监

8、测是临床药学的重要任务，因此，建立高效准确，经济适用的CsA血药浓度监测方法意义重大。HPLC法已普遍应用于CsA血药浓度的测量[5]，其优点是灵敏快速，缺点是样品处理繁琐复杂，对操作人员要求高。另外，70℃高温使色谱柱使用寿命缩短[6]，经济成本增加，但相比免疫学方法，如单克隆、多克隆荧光偏振免疫法[7-8]，酶免疫增强法[9]，MAb亲和柱免疫测定法[10]等仍较经济