浙江省葡萄炭疽菌对甲基硫菌灵与戊唑醇抗药性探究

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1、浙江省葡萄炭疽菌对甲基硫菌灵与戊唑醇抗药性探究　　摘要：【目的】了解浙江地区葡萄炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）对苯并咪唑类杀菌剂和甾醇脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂的抗药性现状，为其防治提供依据和指导。【方法】采用区分剂量法测定了浙江省临安市、诸暨市和金华市的3个葡萄重要产区的108个葡萄炭疽病菌株对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性，并对甲基硫菌灵敏感和抗药性菌株中的β-tubulin基因进行了扩增、测序和比较。【结果】所采集菌株群体对甲基硫菌灵的抗药性频率为37.04%，且均为高水平抗药性菌株（BenHR），BenHR对多菌灵和乙霉威表现双重抗药性，其β-

2、tubulin基因的第200位密码子从TTC突变为TAC，导致第200位氨基酸从苯丙氨酸（Phe）突变为络氨酸（Tyr）。所采集菌株群体共检测到33个（30.56%）对戊唑醇表现低水平抗药性的菌株。【结论】浙江地区葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、乙霉威产生了严重的抗药性，对DMIs类杀菌剂戊唑醇的抗药性发展迅速。关键词：葡萄炭疽病菌；甲基硫菌灵；乙霉威；戊唑醇；抗药性；β-tubulin基因中图分类号：S663.1文献标志码：A10文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0665-04葡萄是我国重要的果树，近10年栽培面积和产量一直呈上升趋势[1]。浙江省地理位置优越，葡萄产业发展迅速，

3、到2010年，全省已有葡萄栽培面积2万hm2以上。葡萄作为重要的果树经济作物，已成为浙江省农民增收的重要渠道。葡萄炭疽病是葡萄上重要的真菌病害之一。胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）Sacc.）是引起该病的病原菌之一，有性世代属于子囊菌亚门，子囊菌纲，球壳菌目，小丛壳属的围小丛壳菌（Glomerelciagulata（Ston）Spauldetschrenk），自然条件下罕见[2]。胶孢炭疽菌的寄主广泛，不同的专化型可以侵染多种不同的作物，如香蕉、杧果、辣椒、草莓、苹果、桃等[2-6]，且因与寄主之间协同进化和受环境影响如农药等因素的作用，产

4、生的变异相对较多，也较快。因此，对这些变化的跟踪和研究也非常有必要，国内外也有很多相关研究[4]。目前生产上用于葡萄炭疽病防治的主要药剂有苯并咪唑类的多菌灵和甲基硫菌灵，甾醇脱甲基抑制剂类（DMIs）的戊唑醇和咪鲜胺等。国内外在很多种致病真菌上已有关于对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的报道，如小麦赤霉病菌（Fusariumgraminearum）[7-8]和灰霉病菌（Botrytis10cinerea）[9]。国内，叶佳等[10]报道的浙江省葡萄炭疽病菌已对甲基硫菌灵产生了严重的抗药性，但具体抗性机制还不清楚。叶佳等[9]报道浙江省葡萄炭疽病菌已对戊唑醇出现了敏感性分化，但进一步的发展情况还有待

5、研究。本研究定性测定了从浙江省葡萄重要产区采集的108株葡萄炭疽病菌株对甲基硫菌灵、多菌灵·乙霉威和戊唑醇的敏感性，并研究了葡萄上胶孢炭疽菌的对甲基硫菌灵的抗性分子机制。1材料和方法1.1菌株的采集、分离和鉴定1.2供试药剂1.3对甲基硫菌灵的抗药性检测1.4甲基硫菌灵抗性菌株对多菌灵·乙霉威的双重抗药性测定1.5葡萄炭疽病菌β-tubulin基因序列的扩增和测序选取对甲基硫菌灵的敏感性菌株和抗性菌株各4株，在PDA培养基上于25℃黑暗条件下培养7d后，用灭过菌的载玻片刮取菌丝，放入灭过菌的研钵中。在研钵中加入适量液氮并研磨成粉末状。DNA提取采用真菌基因组DNA快速抽提取试剂盒（SK208

6、2）（上海生工）。引物序列根据已经报道的引物序列，TubGF（5’-TCTCGATGT-TATCCGCCG-3’），TubGR（5’-TGAGCTCAGGAACACTGACG-3’）[11]，由上海生工生物合成。PCR扩增采用即用PCR扩增试剂盒（上海生工）。PCR参数为94℃预变性5min，然后经94℃变性60s，5410℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸5min[11]。PCR产物经电泳，割胶纯化回收后，直接送上海生工测定，结果用软件进行数据处理。1.6对DMI类杀菌剂戊唑醇的抗药性检测2结果与分析2.1葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵的抗药性频率2.2对多菌灵和乙霉威的

7、双重抗药性2.4葡萄炭疽病菌对戊唑醇的抗药性频率3讨论对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性菌株主要有两种类型：BenR1和BenR2。在苯并咪唑类杀菌剂使用以前，田间菌株为BenS，BenS菌株对苯并咪唑类杀菌剂敏感、同时对乙霉威表现抗药性（二者之间存在负交互抗药性）；苯并咪唑类杀菌剂大量连续使用以后，田间开始出现BenR1菌株。BenR1对苯并咪唑类杀菌剂表现为高水平抗药性，但对乙霉威敏感。于是多菌灵和乙霉威的复配制