葡萄糖氧化酶生产技术

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1、葡萄糖氧化酶生产技术1、概说：1929年英国细菌学家费莱明发现一种霉菌的培养液能抑制葡萄球菌的生长，经鉴定将这种霉菌命名为点青霉。点青霉产生外生孢子，成熟后都可能在空气中飞扬。点青霉的营养体为无色或淡色的菌丝体,菌丝各细胞之间有横隔膜,细胞内通常为多核.整个菌丝体分为伸入营养基质中吸取营养的基质菌丝和伸向空气中的气生菌丝.在气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗,顶端以特殊的对称或不对称的扫帚状的方式分支,称为帚状枝.分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗,在瓶梗上着生分生孢子链.分生孢子为球形至卵形,呈绿色,蓝色或黄色,即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色.2

2、、生产工艺使用菌种：点青霉（Penilliumnotatum）（1）、试管斜面菌种：培养基：葡萄糖5%硝酸钠0.2%硫酸镁0.05%磷酸氢二钾0.1%氯化钾0.05%硫酸镁0.001%琼脂2%(视培养基硬度而定：斜面看起来水份充足而培养基又整固不流动为宜)消前PH自然用18*180mm的试管，每支装量9ml上述培养基，包扎好后采用121℃消毒30min，消毒后制成试管斜面备用。用消毒好的接种环在无菌的条件下，从原种中取一环于装有2ml无菌水的试管中，制成分生孢子悬浮液，备用。从上述分生孢子悬浮液中取一环均匀地涂在制备好的试管斜面上，然后置于28℃的恒温培养箱中培

3、养7-8d左右，镜检无杂菌，且绿色的分生孢子应长满斜面，并能看到金黄色的露珠状分泌物，冰藏备用。（2）、克氏瓶子斜面菌种培养基：葡萄糖5%硝酸钠0.2%硫酸镁0.05%磷酸氢二钾0.1%氯化钾0.05%硫酸镁0.001%琼脂2%(视培养基硬度而定：斜面看起来水份充足而培养基又整固不流动为宜)消前PH自然用250ml的克氏瓶，每瓶装量60ml上述培养基，包扎好后采用121℃消毒30min，消毒后制成斜面备用。用消毒好的接种环在无菌的条件下，从培养好的试管母斜中取一环，于5ml无菌水的试管中制成分生孢子悬浮液，备用用消毒好的接种环从上述分生孢子悬浮液中取一环均匀地涂

4、在制备好的克氏瓶斜面上，然后置于28℃的恒温培养箱中培养7-8d左右，镜检无杂菌，且绿色的分生孢子长满斜面，并能看到金黄色的露珠状分泌物，冰藏备用。（3）、上罐菌种制备在无菌条件下，将培养好的克氏瓶斜面菌种每瓶用60ml无菌水洗下菌苔（不要培养基），倒入消毒好的接种瓶中，包扎好备用接种量：（0.08～0.1%）（4）、发酵罐培养发酵罐空消:采用压力0.12～0.13MPa、温度125～130℃、消毒40min。培养基：葡萄糖8%氯化钾0.05%硝酸钠0.7%磷酸二氢钾0.05%磷酸氢二钾0.05%硫酸镁0.05%豆油0.01%消前PH7.7投料系数70%夹层加热

5、到90℃,然后实罐进蒸汽升压至0.08～0.9MPa，控制压力在0.1MPa、温度120℃、消毒25～30min。消毒完后，夹层水冷，罐压降至0.05Mpa左右时，实罐通无菌空气控制罐压0.03～0.05Mpa，培养基冷至28℃，采用无菌操作接种。工艺参数：培养温度：26～28℃PH：6.3～6.8搅拌速度:240r/min通气量：1:0.6vvm罐压：0.03～0.05Mpa培养时间:约68～72h镜检：培养基不结块，发酵液呈乳白色，即停止发酵。3、后处理技术：发酵结束后，静置12h（嫌气封罐），使菌丝自溶，细胞内酶释放出来；放出后加入0.05%山梨酸或苯甲酸

6、（不应用铁制器盛放），低温避光保藏。发酵液放罐后，先经细菌分离机分离，取上清液，再用超滤浓缩。超滤器（压力控制在0.2Mpa以内）浓缩方法：先用超滤水正循环20min，清洗超滤器中的防腐剂，然后将经过细菌分离机分离出来的上清液按100kg循环1h左右浓缩，取浓水，弃清水。浓缩结束后，先用超滤水正循环20min左右将超滤器冲洗干净，然后采用反洗的方法：先用PH=2的柠檬酸水约200kg循环30min，再用超滤水将超滤膜冲洗干净，然后用PH=12的氢氧化钠和次氯酸钠混合水循环30min，再用超滤水将超滤膜冲洗干净，然后用PH=2的柠檬酸水洗直至出水PH=7为止。然后

7、在超滤膜中灌入8～10%的甲醛溶液保护。4、葡萄糖氧化酶活力测定（1）、试剂①、2%葡萄糖磷酸缓冲液称取20g无水葡萄糖，用0.06M、PH5.6磷酸缓冲液溶解，定容至1升②、0.1N标准氢氧化钠溶液③、0.1N标准盐酸溶液④、酚酞指示剂：称取1克酚酞溶于100ml60～90%乙醇中（2）、操作取250ml三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸缓冲液25ml加入1ml酶液，立即放在振荡器上于30℃振荡1h，然后加入0.1N标准氢氧化钠溶液20ml终止反应。用0.1N标准盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸ml数（A），对照系在加酶之前先加入0.1N标准氢氧化钠溶液2

8、0ml，不必振荡，其它操