dna脱碱基位点检测和应用

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1、DNA脱碱基位点检测和应用　　另一方面，由于脱碱基位点产生于正常碱基的缺失脱落，因此在双链DNA双螺旋结构中形成一个空腔，允许小分子进入其中，空腔的体积对进入的小分子具有一定的空间选择性。由于空腔位于双链核酸的内部，具有疏水特性。另外，脱碱基位点对面的碱基，由于失去了配对的碱基，重新具备了形成氢键的能力。因此，结构合适的小分子，能够在空腔内通过疏水和氢键作用，与核酸分子形成稳定的复合物。脱碱基位点的以上特性，使之被应用于小分子检测、核苷酸/SNP检测以及适配体生物传感器构建等方面的研究工作中。本文综合介绍迄今为止检测DNA脱碱基位点的化学探针检测方法，归纳总结DNA脱碱基

2、位点在构建小分子检测元件和生物传感器等方面的应用，并作以展望。2DNA脱碱基位点的化学探针检测法8大量脱碱基位点的检测方法包括32P后标记法、LCMS、ELISA等方法被用于基因中脱碱基位点的检测。32P后标记法具有灵敏度高、特异性好的优点，但也存在操作复杂且具有放射性的缺欠；LCMS结果准确、可靠，但对待测样品的前处理要求高，且需要专业人员进行大型仪器操作等。相比之下，ELISA检测法操作简单，仪器价格低，但由于所用抗体对结构相似的物质一般有交叉反应，降低了检测的特异性。20世纪90年代初发展起来的化学探针法某种原因，因为操作步骤简单、特异性强，且灵敏度合适，成为目前脱

3、碱基位点检测的主要研究方法之一。化学探针根据不同作用机理可分属为共价反应型探针及非共价作用探针两大类。共价反应探针，是利用化学反应将标记分子与脱碱基位点共价联接的一类探针。例如脱碱基位点及其氧化衍生物结构中的醛基基团，能够与氨基基团发生缩合反应，形成稳定的共价结构。基于这个氨醛缩合反应，可合成一端具有氨基基团、另一端为标记基团的共价反应型探针分子，实现脱碱基位点的标记。非共价作用探针，是依靠探针与核酸分子之间的氢键、静电引力、碱基堆积力等弱相互作用力，使探针分子能够进入脱碱基位点，由此改变探针分子的物理信号（吸光度、荧光、电化学等），从而实现对脱碱基位点识别的探针类型。基

4、于以上检测机理，一系列探针可归结为共价反应型探针。如，对（4硝基苄基）羟胺上的羟胺基团能够与脱碱基位点核糖残基的醛基发生缩合反应，将硝基苄基基团共价标记在脱碱基位点上。标记上的对（硝基苄基）羟胺用5′磷酸脱氧核糖4硝基苄基羟胺的单克隆抗体来识别，实现对脱碱基位点的检测，此方法可以检测104个碱基对中出现的1个脱碱基位点，或108fmol/L的脱碱基位点[15]。氨基玫瑰树碱（9Aminoellipticine，图3a）[16]的氨基与脱氧核糖残基的醛基缩合生成希夫碱，根据希夫碱的荧光信号，实现脱碱基位点的检测。用14C甲氧胺滴定含有醛基型脱碱基位点的DNA，生成DNA14

5、C甲氧胺复合物，检测其放射性，实现对脱碱基位点的识别[17]。基于DNA甲氧胺复合物阻断内切酶及聚合酶的作用，不用具有放射性的甲氧胺，也成功的检测了脱碱基位点[18]。目前广泛用来检测脱碱基位点的醛基反应探针ARP（Aldehydereactiveprobe，图3d）[19，20]，由生物素酰肼与对羧甲基羟胺在碳化二亚胺存在下反应生成对烷基羟胺衍生物，然后将生物素酰肼的联氨转换为羟胺而得到。ARP的羟胺与普通脱碱基位点的醛基进行缩合反应，将生物素共价标记在脱碱基位点。标记上的生物素利用生物素/亲和素辣根过氧化物酶检测，可检测小牛胸腺DNA或噬菌体f1DNA经过酸加热处理产

6、生的脱碱基位点，70～100ngDNA样品中可检测出每104个碱基中的1个脱碱基位点。2.2非共价作用探针DNA互补碱基对之间形成的氢键作用力以及碱基与相邻碱基间形成的碱基堆积力，是DNA双螺旋结构稳定的重要因素。碱基脱落后形成的脱碱基位点使局部氢键作用力、碱基堆积力失衡，导致DNA局部结构甚至整体结构趋于不稳定，单个碱基缺失能够降低DNA稳定性3～118kcal/mol[29]。而小分子进入脱碱基位点形成的空腔后，能够弥补这些弱相互作用力，从而利于DNA结构趋于稳定。非共价探针进入脱碱基位点空腔，参与分子间氢键、范德华力、静电引力、碱基堆积力等非共价弱相互作用力，导致探

7、针信号发生变化，实现脱碱基位点的检测[30～32]。C5呋喃环的嘧啶衍生物（图4a）是检测脱碱基位点的一种典型非共价荧光探针。使用C5呋喃环衍生物取代DNA序列中的正常碱基形成C5呋喃环衍生物修饰的DNA序列。此修饰序列与互补DNA序列互不配对形成双螺旋结构时，C5呋喃环衍生物对面位置为腺嘌呤A时，其荧光信号被淬灭。而当互补碱基脱落成脱碱基位点，其荧光信号相比于对面为腺嘌呤时增强7倍，根据此荧光信号变化可检测脱碱基位点[33，34]。Buzzeo等[35]设计合成了具有电化学活性的非共价探针雷德蒙红（图4c）。当固定在金电极表