实验五 胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响

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1、实验六胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响实验五葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖课程名称：生物化学与分子生物学实验课年级：2004专业、层次：临床医学本科　　　　　　授课教师：汪宗桂职称：助教　　　　　　学时：3学时基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》教学目的与要求：1、观察胰岛素和肾上腺素对家兔血糖浓度的影响。2、掌握血糖浓度的测定方法。3、掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理和方法。4、掌握血糖浓度的正常参考值，了解血糖测定的临床意义。大体内容与时间安排：1、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的原理

2、5min2、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的注意事项5min3、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理5min4、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的操作改动及注意事项5min5、学生做实验100min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理2、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项难点：葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项5一、实验原理（一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响激素是调节机体血糖浓度的重要因素。胰岛素能降低血糖，肾上腺素等激素能升高血糖。本实验给两只家兔分别注射

3、胰岛素或肾上腺素，取注射前、后兔的静脉血，测定血糖含量，观察注射前后血糖浓度变化，从而了解胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响。（二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖本实验是葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化物酶(POD)相偶联发生的偶联反应。第一步：葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。第二步：过氧化物酶在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物(苯醌亚胺非那腙)。二、操作步骤（一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响1、动物准备

4、：取正常家兔两只，实验前预先饥饿16小时，称体重(—般为2-3kg)。2、注射激素前取血：—般多从耳缘静脉取血：剪去耳毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，于放血部位涂一薄层凡士林，再用粗针头或刀片刺破静脉放血。采用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法时，则将静脉血收集于干净试管中,静置至血清析出。取血完毕，用干棉球压迫血管止血.3、注射激素：—只兔子注射胰岛素；皮下注射，剂量为0.75U/kg体重。另一只兔子注射肾上腺素：皮下注射，剂量为0.4mg/kg体重。分别记录注射时间。54、注射激素后取

5、血：方法同上；取血时间：肾上腺素注射后30分钟；胰岛素注射后1小时。从注射胰岛素的兔子取血后，应立即用10ml250g/L葡萄糖做腹腔内或皮下注射，以防家兔发生胰岛素休克(低血糖休克)。5、测定血糖：分别测定各血样的糖含量，方法请见实验四“血糖测定”。6、计算：计算注射胰岛素后血糖降低和注射肾上腺素后血糖增高的百分率：△BS=注射后BS—注射前BS；“+”值表示BS升高；“—”值表示BS降低(BS—血糖)。（二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖1、取试管3支，按下表操作。葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤加入物

6、(ml)空白管标准管测定管血清－－0.01葡萄糖标准应用液－0.01－蒸馏水0.01－－酶酚混合试剂1.51.51.5混匀，置37℃水浴中，保温15min，加2ml水混合后在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。2、计算：三、注意事项（一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响1、剃兔耳毛时，先用水润湿后在剃毛，要求耳缘静脉四周要剃干净，否则取血时易引起溶血；2、选用腹部皮肤作胰岛素和肾上腺素皮下注射，一手轻轻提起腹部皮肤，另一手持注射器以45°进针，针头不要刺入腹腔，更不要穿破皮肤

7、注射到体外。5（二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖1、最后加酶酚混合试剂，各管反应时间应一致；2、因用血量甚微，操作中应直接加样本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠；3、葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量；4、严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。四、思考题葡萄糖氧化酶法不能直接测定尿液葡萄糖含量；而且严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。为什么？小结葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的线性范围至少可达22.24

8、mmol/L，回收率94%～105%，批内CV为0.7%～2.0%。批间CV为2%左右，日间CV为2%～3%。葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较，73份标本葡萄糖氧化酶法均值为8.31mmol/L，已糖激酶法均值8.21mmol/L，相关系数为0.9986，回归方程y=1.0026x－2.29。本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原