第11章流式细胞技术和流式细胞仪.doc

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1、流式细胞技术和流式细胞仪流式细胞仪首页→第十一章流式细胞技术和流式细胞仪一、荧光染料在流式细胞术中的应用（一）碘化丙啶染色碘化丙啶(propioliumiodide，PI)能嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。1.小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法（1）从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。（2）去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。（3）小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下

2、重悬细胞于HBSS中。（4）将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mLPI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。（5）测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%NonideP40水。2.培养细胞DNA的流式细胞仪分析（1）从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次。（2）加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟。（3）用吸管反复次打细胞，

3、使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。3.完整细胞DNA的PI染色（1）70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液。（2）室温条件下加入PI染色一批细胞（105～106细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。（二）吖啶橙染色1.DNA和RNA的鉴别染色利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，

4、但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下：（1）试剂：1）溶液A：低温保存，稳定期约2周。TritonX-100(0.1%)0.1mL，1mol/LHCL8mL1mol/LNaCL15ml蒸馏水76mL，PH1.5（100mL）2）溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。0.01mol/LEDTA10mL,1mol/LNaCL15mL0.4mol/LNa2HPO431.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL蒸馏水24mL，总体积为99mLpH6.03）吖啶橙母液：用吖啶橙/蒸馏水

5、配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。4）注意事项：仪器鞘流系统应保持4℃。氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)（2）方法：1）用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。2）加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。3）应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。（3）注意事项：（1）细胞数保持恒定；（2

6、）核酸与吖啶橙的比例；（3）染色时间及温度。2.单链和双链DNA的鉴别染色（1）试剂：1）HBSS内含1000u/mLRNA酶A，0.2mol/LKClpH1.352）吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5mg/L(16.7μm),0.2mol/LNa2HPO4缓冲液，pH2.6。（2）方法1）2×106细胞悬于1mLHBSS/RNase液中。2）37℃温育1小时。3）将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL0.2mol/LKCl(pH1.35)混匀，20

7、℃30分钟。4）加2mL吖啶橙染色2分钟。5）绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。（三）Hoechst33258染色以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。1.试剂：（1）用培养基配制33mg/LBrdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。（2）染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。2.方法：（1）将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。（

8、2）根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。（3）孵育后，摇散细胞以传代培养。（4）直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，需用330～360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项技术可用于直接测定细胞G2期