细胞渗透性实验步骤.docx

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1、细胞渗透性实验实验材料：1.Caco-2细胞；2.培养基DMEM(高糖，含Gln，无丙酮酸，Gibco/Invitrogen,cat.no.41965-039)；a)完全培养基DMEM+10%FCS+1%NEAA(Gibco/Invitrogen,cat.no.11140-035)；b)DMEM-双抗培养基DMEM+10%FCS+1%NEAA+1%双抗（Gibco/Invitrogen,cat.no.15140-122）；3.0.25%胰酶+EDTA；4.HBSS（Hank’sbalancedsaltsolution）(ca

2、t.no.H1387)配制1L，加入HEPES（终浓度25mM）和NaHCO3（终浓度0.35g/L）,调整PH=7.4并过滤除菌（如果要模拟小肠酸环境或研究质子依赖的转运机制，则以PH=6.5的甲磺酸代替HEPES，终浓度10mM，调整PH=6.5）；5.DMSO（在药物不溶于HBSS时使用，99.5%纯度，作为共溶剂，使用时DMSO终浓度不能超过1%）；6.[14C]mannitol（suppliedbyNENLifeScienceProducts，具有放射性）或用fluorescentcompoundluciferye

3、llow（需要的药物浓度高于[14C]mannitol）7.分析药物含量的溶剂，如HPLC溶剂；8.BSA，如检测脂溶性化合物则需要BSA；9.配制药物，用上述HBSS溶液按需要的浓度溶解药物，使用前检查配制后的溶液PH值，如PH改变，则调整相应的至7.4或6.5。要点：1.有些药物可能会破坏Caco-2细胞层的完整性，造成通透性升高，一般以[14C]mannitol作为marker，通常完整的Caco-2细胞层通透性为1.2±0.5×10-7cms-1，如果通透系数大于5×10-7cms-1，则认为单细胞层受到了药物的影响

4、，若通透系数大于1×10-6cms-1，则认为单细胞层遭到破坏；2.对于主动转运，首先使用低浓度药物如10μM或更低的浓度进行实验以避免转运蛋白的饱和转运；对于被动运输mM数量级的浓度进行实验，这样，主动运输饱和，此时的运输主要是被动运输。实验器材：细胞培养箱，细胞计数板，37度保湿培养箱和摇床(3mmorbitaldiameter;IKA-SchuttlerMTS4)，37度保温板，跨膜电阻抗（TER）检测仪，带有Millicell-ERS-voltmeter（Millipore）或Evohmepithelialvoltm

5、eter的Endohm组织电阻测量室（WPI），CorningCostarTranswellpermeablesupports(12-wellplates,cat.no.3401)，12-wellcellcultureclusterswithlids(CorningCostar,cat.no.3512)，分析仪器（scintillationcounter,UV-platereader,fluorescenceplatereaderorHPLC(-MS)）细胞准备1提前四周进行Caco-2细胞培养，培养基：DMEM+10%FB

6、S+1%NEAA+5mMGln，培养条件：37℃，5%CO2培养箱中培养。（进行后续实验的细胞至少要在40代以上，对于新解冻的细胞，要至少体外培养2代后使用）2检测细胞活性2.1.1转移细胞至试管中，用沉降法去除细胞团和细胞碎片；2.1.2转移含细胞的上清液至新试管中，PI染色，计数细胞量，死细胞量<5%；3离心细胞400g，5min，去除上清；4重悬细胞在DMEM-双抗内（细胞浓度0.6×106cellsml-1）；5在12孔板内放入filters（直径12毫米），滴加0.1ml培养基润湿filters2min，滴加0.5

7、ml细胞悬液，每个filter的种植密度约为3×105cellsml-1；6向基底侧加入1.5mlDMEM-双抗培养基；7在37℃培养箱内培养6-16h（不可超过16h）；8弃去顶侧培养基，补加0.5mlDMEM-双抗培养基，目的是去除未贴壁细胞，预防多细胞层的形成；9每两天，弃去基底侧培养，仔细并缓慢的弃去顶侧培养基，向顶侧补加0.5ml新鲜培养液，再向基底侧补加1.5ml新鲜培养液（注意避免枪头接触到细胞层）；10重复上述换液步骤，持续培养细胞至21-29天（培养21天时，细胞已经表达多种转运蛋白和水解酶），结果如下图所

8、示：1.1接种的单层细胞状态检测：使用鬼笔环肽检测或使用细胞核染色观察；实验步骤2实验前12-24h更换培养液（实验过程大约2h）；3准备药物溶液，预热所有溶液至37℃，在工作台上放置保温板；4准备新的12孔板，加入1.5mlHBSS，轻轻倒出单细胞层上的培养液，并转移至含HBSS的培养板