课题3--血红蛋白的提取和分离学案.doc

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1、09-10学年高明区纪念中学高三级生物科学案执笔：钟日文审核：备课组长签名：课题（理）课型课时讲学时间班级姓名课题3血红蛋白的提取和分离新课28月日【学习目标】1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理【重难点】教学重点：凝胶色谱法的原理和方法教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【复习】DNA的粗提取和鉴定完成下列实验步骤：【基础知识】阅读课本P58－63，完成下列空格一、凝胶色谱法1、概念：也称做；是根据分离蛋白质的有效方法。2、原理（1）由构成的凝胶，内部有许多贯穿的的。（2）当不同

2、的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，从而使不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制的对溶液pH的影响，维持pH。2、配制：由种缓冲剂溶解于中配制而成，通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳1、概念：指在电厂的作用下发生的过程。2、原理：在一定的下，、等生物大分子的可解离基团会带上或，在的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子的差

3、异及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中的分离。4、方法：常用的电泳方法有和。测定蛋白质分子量时通常使用。四、实验操作1、样品处理：通过、、等操作收集血红蛋白溶液。(1)红细胞的洗涤：目的是。分离时采取，直至上清液中没有，表明红细胞已洗涤干净。过程：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色(2)血红蛋白的释放：在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把离心后，将试管中的液体用过滤、除去，于中静置片刻后

4、，分离出下层的。2、粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入，将放入一定量适宜浓度的中，透析。(2)目的：将的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。3、纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。＿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱(2)凝胶色谱柱的装填①材料：本实验使用的是。②方法：凝胶用充分溶胀后。配成，一次性倒人色谱柱内。

5、不能有存在；不能发生流干露出凝胶颗粒的现象。色谱柱的装填过程。步骤操作要求①操作要求色谱柱垂直固定在支架上②计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量③配制悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴④装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打⑤缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h(3)样品的加入和洗脱①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。b、加样：用小心地将1mL透析后的样品加到的顶端，注意不要破坏。c、加样后：打开下端出口，使样品渗入内。②洗脱：加入，打开下端出口，进行。基本过程是：调节缓冲液面

6、→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是。五、操作提示1、红细胞的洗涤：、与十分重要。过少，无法除去血浆蛋白；过高和过长会使等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在中膨胀，可以将加入其中的用加热，加速膨胀。3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。4、蛋白质的分离：如果红色区带地移动，说明色谱柱制作成功。【探究归纳】一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?二、洗涤红细胞时为什么

7、不能用蒸馏水代替生理盐水?三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?四、凝胶色谱法的原理归纳【课堂总结】血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定【典例导析】类型一凝胶色谱法分离蛋白质【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由

8、于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，