第十六章细胞的破碎ppt课件.ppt

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1、第十六章—细胞破碎(CellDisruption)生化分离过程的一般流程发酵液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性√√3.1概述胞外型：一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药、保健产品和工业用。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取

2、过程只需直接采用过滤和离心进行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。概述胞内型：几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠

3、杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力（物理、化学、酶或机械的方法）破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。概述微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。基于遗

4、传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。革兰阳性细菌细胞壁结构模式图革兰阴性细菌细胞壁结构模式图3.2细菌细胞壁结构和化学组成细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycanchain），借助短肽交联而

5、成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。☆阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细胞壁成分的10％左右,由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。

6、☆革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此外细胞壁还含有大量磷壁酸。酵母菌酵母菌一般有很高的营养价值，特别是含有50%蛋白质，很多B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质。畜禽饲料(单细胞蛋白，SCP)食品添加剂（啤酒酵母）细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的

7、阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。植物细胞细胞壁的化学组成组分结构和分类纤维素β－1，4－D－葡聚糖半纤维素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖果胶物质半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖

8、和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白各种酶类凝集素组织捣碎匀浆机3.3细胞壁的破碎3.3.1破碎率的评价式中：N0（原始细胞数）N（经t时间操作后保留下来的未损害的细胞数）(1)直接计数法直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。(2)间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。3.3.2细胞破碎的方法目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。