生化方法学及仪器应用.doc

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1、生化检测方法及仪器应用两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）

2、、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。（两点法）3．连续监测法（速率法）对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联

3、法测定尿素等，也可用连续监测法。4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参

4、数的确切意义。一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。1．试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。4．主波长主波长（primarywavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。5．次波长次波长（secondarywavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波

5、长、干扰物质光吸收有关的波长。 6．反应方向 反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。 7．样品量 样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。 8． 第一试剂量 第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。 9． 第二试剂量 第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。 10．总反应容量 总反应容量（tota

6、l reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。 11．孵育时间 孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。 12．延迟时间 延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。 13．连续监测时间 连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始

7、，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。 14．校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。 15．校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。 16．线性范围 即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测