基因工程考试复习.doc

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1、2012级《基因工程》考试复习姓名：__________电话：___________一基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来,或者人工合成的基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,通过一定的方法,转移到另一种生物体(受体)的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.基因工程是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。基因工程三要素：供体受体载体基因工程的操作步骤：切→接→转→检基因

2、工程研究的内容：基因的分离与克隆转化体的筛选[书本]:（GE克隆载体的研究载体的选择与构建外源基因整合和表达的检测GE受体系统的研究基因转化受体系统的建立外源基因在细胞中的表达调控目的基因的研究基因转化技术外源基因的遗传GE工具酶的研究GE新技术的的研究）基因工程诞生的理论基础及技术基础1)理论基础20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代，相

3、继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。2）技术基础限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发现GE载体的发现转化（导入）方法基因表达6如何正确看待基因工程(正反两方面）虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：①红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。②白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。③绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：问题1

4、用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。二DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。植物组织中DNA的提取CTAB的作用:CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合

5、物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。动物组织中DNA的提取SDS的作用:溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。载

6、样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆

7、菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，

8、结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。碱变性法提取质粒DNA方法及原理碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体D