常用分子克隆实验方法.doc

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1、常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。(1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2)高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3)核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4)低速离心

2、沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5)75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6)核酸洗脱。加入约55ulTE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少

3、了污染。(1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1mlCTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。(2)氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。(3)核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。(4)清洗沉淀。轻加入1ml75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心

4、管架上晾干5min。(5)溶解DNA。加50ul含RnaseA（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul电泳检测后，低温冷藏。6二、植物总RNA的小量提取操作前必须对枪头，桌面等进行酒精擦洗，最好戴口罩，并及时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnasefree.方法1：离心柱法，其特点是无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，DNA污染少。(1)充分研磨。取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入约500ul溶液B，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；(2)高速离心去杂质。用1ml

5、吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，常温下，10,000rpm离心5min，取上清（约400ul）至已充分甩干的吸附柱中；(3)核酸吸附。往柱中补加1/4体积异丙醇，静置3min，然后5000rpm离心30s，弃滤液，滤液较多时，宜分两次，每次15s；(4)75%乙醇清洗。往柱中加400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液。重复此步骤一次，再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新Rnasefree1.5ml管；(5)核酸洗脱。往柱中硅土加入45ulDEPC水，静置3min，10

6、,000rpm离心1min，所得滤液即为RNA样品。可取5ul通过普通琼脂糖电泳检测提取效果，样品应立即加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）℃。方法2：Trizol法，结合氯仿抽提，异丙醇沉淀。(1)充分研磨。取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入约500ulTrizol溶液，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；或者将粉末转入1.5ml离心管，再加500ulTrizol溶液，剧烈混合1min。(2)氯仿抽提。用1ml吸头将所有溶液移至1.5ml

7、离心管中，加入1倍的氯仿，振荡混匀，10,000rpm离心3min，取上清重复抽提1遍。(3)核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇，混匀，10,000rpm离心5min，弃上清。(4)清洗沉淀。轻加入1ml75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，横放于离心管架上，在超净台中吹5min。(5)溶解RNA。加入DEPC处理过的水40-50ul，静置几分钟直至沉淀溶解，可通过普通琼脂糖电泳检测提取效果，再补充加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）。6三、质粒小提方法1：碱裂解法。(1)收获

8、菌体。摇过夜（12h以上）的菌液按1.5ml分装，冰浴，10,000rpm离心30s，倒掉上清，倒置或晾放于离心管架上，同时用小枪头吸走管底和盖上的残液。(2)溶菌与变性。加入预冷的溶液I100ul，混合器充分悬浮菌液，冰浴。逐管加入溶液IIA（2%SDS溶液，无需预冷）100ul，全部加完后每管补加预冷的溶液IIB（0.4MNa