聚丙烯酰胺凝胶方法.doc

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1、（1）1MTris-HClPH=8.0(Tris121.1g，超纯水定容到1L，HCl调节PH值，高压灭菌)；（2）0.5MEDTAPH=8.0（Na2EDTA·2H2O186.1g，超纯水定容到1L，NaOH调节PH值，高压灭菌）；（3）50×TAE（Tris242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，超纯水定容到1L）；（4）5×TBE（Tris54g，硼酸27.5g，EDTA（0.5M，PH8.0）20mL，超纯水定容到1L）；（5）40%丙烯酰胺（丙烯酰胺190g，甲叉双丙烯酰胺10g，超纯水定容至500mL，棕色瓶保存）；（6）6%聚丙烯酰胺（尿素420g，5×TB

2、E200mL，40%丙烯酰胺150mL，超纯水定容至1L）；（7）10%APS（APS2g，去离子水定容20ml，4℃保存）；（8）变性剂（去离子甲酰胺50mL，溴酚蓝0.025g，二甲苯青FF0.025g，EDTA1mL，4℃保聚丙烯酰胺凝胶的制备存）；（9）染色液（无水乙醇60mL，硝酸银1g，醋酸3mL，去离子水定容至600mL，棕色瓶保存）；（10）显影液（NaOH18g，去离子水定容至600mL，用前加0.5mL的甲醛）；（11）10mg/mL溴化乙锭EB（溴乙锭1g，超纯水定容至100mL，棕色瓶保存）。（1）用洗洁精清洗两块玻璃板（注意，两块玻璃板分开清洗），然后

3、分别平放在水平桌面的垫板上。（2）首先用95%的酒精均匀擦洗两块玻璃板（每块板分别用新手套，防止亲水板和疏水板之间的污染），等待晾干。（3）配置亲水基（亲水硅烷30μL，醋酸7.5μL，无水乙醇1.5mL），摇匀之后，迅速且均匀地涂抹在亲水板上；吸取400μL-600μL的剥离硅烷打在疏水板上，并迅速且均匀地涂抹在上面。（4）两块板自然风干后，在亲水板上放上已洗干净的垫片，之后将疏水板放在其上面，并用三对夹子固定，夹力相当的夹子对称。（5）用量筒称取60mL6%的聚丙烯酰胺溶液倒入锥形瓶中，并加入400μL的10%过硫酸铵、30-80μL的TEMED，轻轻摇匀。（6）一手稍微倾

4、斜（10°左右）玻璃板，一手将配置好的聚丙烯酰胺溶液平缓地倒入两玻璃板之间，在此过程中要防止气泡的产生。倒好胶之后平放玻璃板，插上梳子，并在插梳子的两边夹上夹子。（7）静止1h-2h，待胶完全凝固后，便可进行电泳。（4）两块板自然风干后，在亲水板上放上已洗干净的垫片，之后将疏水板放在其上面，并用三对夹子固定，夹力相当的夹子对称。（5）用量筒称取60mL6%的聚丙烯酰胺溶液倒入锥形瓶中，并加入400μL的10%过硫酸铵、30-80μL的TEMED，轻轻摇匀。（6）一手稍微倾斜（10°左右）玻璃板，一手将配置好的聚丙烯酰胺溶液平缓地倒入两玻璃板之间，在此过程中要防止气泡的产生。倒好

5、胶之后平放玻璃板，插上梳子，并在插梳子的两边夹上夹子。（7）静止1h-2h，待胶完全凝固后，便可进行电泳。3.2.4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）将已经完全凝胶的玻璃板的夹子取下，拔出梳子，在水龙头下清洗玻璃板的两面，用抹布擦干之后，按装在电泳槽上，并在电泳槽的正极倒入1×TBE溶液，负极加入0.5×TBE溶液。（2）接通电源，恒定功率65W预电泳30min。（3）将PCR扩增好的产物每管中加入10μL的变性剂，离心，放入PCR仪中进行94℃5min的变性，之后立刻置于冰上。（4）用1mL的移液枪吸取0.5×TBE的缓冲液吹打加样孔，重复几次，之后取变性后的混合液5μL迅速上样。

6、电泳时用同样的恒定功率电泳2h-2.5h。3.2.4.3银染（1）电泳结束后，关闭电泳仪，用手轻轻的揭开两块玻璃板，将附有凝胶的玻璃板放入染色液中进行染色10min，期间不停的用手水平摇动染色槽。（2）将附有凝胶的玻璃板取出，放在去离子水中冲洗10s，立即取出，稍微沥干。（3）在显影液中加入0.5mL的甲醛，并摇匀，把附有凝胶的玻璃板放入其中，水平摇动，直到条带清晰地出现。（4）取出附有凝胶的玻璃板，放入去离子水中冲洗2-3次，取出晾干后，在灯箱上观察并用相机拍照。