酶切反应注意事项.doc

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1、1、DNA纯度一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度：(1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。(2)一般来说，少

2、量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质，就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA片段的定性分析。(3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。(4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂质常

3、常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现酶的第二活性。2、DNA甲基化限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。Dam甲基化酶在5’GATC3’的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。若出现甲基化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂

4、酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。3、星号活力又称第二活力，是指该改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。如EcoRI的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。高浓度甘油、高PH、低离子强度、β-巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星号活力。厂家提供的酶一般存放在50%甘油溶液中，若酶量站反应体系的1/10以上，将可能导致星号活力。小的反应体系若长时间在恒温水

5、浴锅中进行酶切反应，因Eppendorf管里的内外温差将导致水分蒸发，蒸气凝结在盖子上而使反应体积缩小非常明显，将改变反应体系的组成，而容易产生星号活力，因此长时间进行酶切反应，宜使用空气恒温箱为保温设备，可避免水分蒸发和凝结。4、终止限制性内切核酸酶反应的方法(1)加EDTA以Mg2+,使酶失去辅助因子而终止酶切反应；(2)65℃下保温5-10min而使酶失活。但是有些酶在此温度下仍有活性，这种酶就不能用高温失活方法来终止酶切反应；(3)加SDS至终浓度0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变形；(4)用等体积酚抽提酶解产

6、物，这种方法使酶活性丧志最彻底，灭火后的样品用乙醇沉淀法回收DNA；