镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤.doc

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1、镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！1、    过柱前的注意事项：a、    样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；b、    包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；c、    确保样品及BindingBuffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；2、    过Ni柱的操作步骤：a、用去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；b、5×柱体积的ChargeBuffer（50mMNiSO4）充电；c、5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子；d、  

2、  10×柱体积的BindingBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；e、    上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；f、    20×柱体积的WashingBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液；g、    ElutionBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；h、    10×柱体积的BindingBuffe

3、r洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。3、柱的清洗与保存：a、去Ni离子：a、5×柱体积的StripBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,50mMEDTA，pH7.4）洗涤；b、10×柱体积的去离子水洗涤。b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5MNaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。