尾叶桉叶绿体.docx

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1、高盐低pH值法提取尾叶桉叶绿体DNA的研究一、目的：探究尾叶桉叶绿体DNA（chloroplastDNA，cpDNA）的提取方法，采用高盐低PH法或改良高盐低PH法提取尾叶桉组培苗、绿色愈伤组织和幼嫩叶片的cpDNA，并镜检和荧光显微观察完整叶绿体纯度及完整性、分光光度计检测提取物cpDNA的A260/A230确定有无盐类、糖类的污染泡桐叶绿体游离及其ＤＮＡ提取方法的筛选和A260/A280、琼脂糖凝胶电泳检测cpDNA的质量（纯度、得率、电泳条带分布、有无拖尾现象、明暗度）、PCR技术检测能否扩增出目标片段方案一：用琼脂糖电泳，利用cpDN

2、A特异引物进行检测可以借鉴“杨树叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法的研究（崔彬彬）”确定有无核污染后，以随机引物或cpDNA特异引物检测方案二：通过核基因组、cpDNA两种特异引物的PCR鉴定——郑建树等:苎麻叶绿体DNA的提取及分析方案三：利用叶绿体基因组在进化中高度保守的特点，选取烟草叶绿体基因组中的保守序列设计引物P1——茶树叶绿体DNA提取方法研究（陈春梅），以期初步探究出适合提取尾叶桉cpDNA的方法及优化提取工艺为尾叶桉叶绿体基因组结构、功能等方面的深入研究奠定基础。[还可选用限制性酶切检测]二、原理：1、实验由三步组成：（1）高盐

3、低PH法提取纯的完整叶绿体（无组织残渣、细胞壁、细胞核和其他细胞器、RNA、核DNA、线粒体DNA污染，不可加蛋白酶否则裂解了叶绿体），并镜检和荧光显微观察完整叶绿体纯度及完整性；（2）提取cpDNA（可参考SDS、CTAB法等）：裂解叶绿体膜（SDS、CTAB、β-巯基乙醇、DTT等蛋白变性剂能溶解胞膜蛋白而破坏细胞膜）、二价金属离子螯合剂EDTA保护DNA（抑制DNase）、添加RNase降解叶绿体RNA、蛋白酶酶解蛋白、酚及氯仿抽提除蛋白尽管色素的功能各异,但都是以叶绿素-蛋白质复合体的形式存在于叶绿体膜中、脂质；（3）检测提取物2、c

4、pDNA提取方法比较目前用于高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNaseI法、蔗糖密度梯度离心法、Percoll梯度法、无水法、高盐低pH法等。传统提取高等植物cpDNA的方法有蔗糖密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法和无水法等，但它们都有不足，或得率较低，或纯度不高，而且都费时，不易操作。杨树叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法的研究利用高盐低pH法提取茶树cpDNA具有操作简便、用时短、得率较高等优点。蔗糖密度梯度法提取cpDNA时，密度梯度液不易保持，需要配备水平转头高速离心机，利用普通水平离心机和高速角转离心机代替水平转头高速离心机对叶

5、绿体粗提液进行离心，分层效果均不理想，主要是因为普通水平离心机无法提供足够的离心力，而高速角转离心机无法保持蔗糖密度梯度与蔗糖密度梯度液相比，Percoll密度梯度液更容易保持，且可以使用普通水平离心机，离心时间短，分层效果好，但Percoll分离液价格高，且得到的叶绿体层窄。茶树叶绿体DNA提取方法研究（参考网价：620元/100ml，价格昂贵，消耗大，不宜大量使用）DNaseI法容易导致cpDNA得率低下。高盐低pH法：实验材料高速匀浆时会产生大量静电，未与蛋白质解聚的染色质或核DNA由于静电相互作用吸附到叶绿体膜上，高离子强度介质介入，

6、阻碍了叶绿体膜吸附核DNA提取cpDNA时，吸附于cpDNA上由酚类物质氧化而来的醌类物质极难除去，在缓冲液中加入抗氧化剂，如抗坏血酸-巯基乙醇等，能有效阻止酚类物质氧化，可提高cpDNA的质量。可用DTT代替常用的β-巯基乙醇，DTT和巯基乙醇作用相似，但DTT的刺激性气味小毒性低。为了减少核DNA污染，本研究在叶绿体裂解之前，用DNA消化酶37水浴处理叶绿体溶液，再用EDTA终止酶解，有效的减少了核DNA污染。茶树叶绿体DNA提取方法研究——陈春梅三、材料：尾叶桉组培苗、绿色愈伤组织（2—4个月）、鲜嫩叶片（选用）四、仪器：剪刀、匀浆机J

7、J-2组织捣碎匀浆机，胡木林老师实验室，菠菜叶片匀浆完整叶绿体50%以上、台式离心机、离心管（50mL）、微量可调移液枪、恒温水浴锅、显微镜、荧光显微镜（胡木林老师实验室）、分光光度计（A260/A280值）、核酸和蛋白分析仪、电泳仪（琼脂糖电泳检测）、PCR五、试剂提取叶绿体：匀浆：缓冲液A（50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，0.25mmol/LVc，1.5%PVP，PH：3.6）缓冲液B（50mmol/LTris，25mmol/LEDTA，1.25mol/LNaCl，0.25mmol/LVc，

8、10mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1%BSA即牛血清蛋白使用的BSA不能含有脂肪酸，以防止脂肪酸氧化造成膜溶解，PH：8.0）缓冲液C（7mmol/LEDTA-Na