怎样选择凝胶.doc

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1、如何选择凝胶生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。1.测定------分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的SuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。2.选择------层析方法若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一]

2、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、SephacrylHR依据分子量将样品分成不同组份。二]用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。三]体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。3.纯化------大量粗品处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharos

3、ebigbeads、sepharoseXL、sepharosefastflow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。4.纯化------硫酸氨样品硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用SephadexG-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在

4、八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。5.纯水-----糖类分子固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。6.纯化------膜蛋白膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。7.纯化--

5、----单抗、抗原*单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、ProteinG和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProteinASepharoseFF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProteinA用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤Superdex200，很容易去除。*疏水层析PhenylSepharoseHP亦很适合纯

6、化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。*HiTrapIgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mgIgM。HiTrapIgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。8.纯化------重组蛋白重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amershambiosciences提供

7、三个快速表达、一步纯化的融合系统。一]GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。2．蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgGSepharose6FF纯化。二]含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9.纯化------包涵体蛋

8、白包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学