上海市腹泻病监测技术方案.docx

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1、上海市腹泻病监测的实验室检测标准操作程序第一部细菌学检测的技术方案一）霍乱弧菌检测操作程序1.标本检测流程图：粪便或肛拭子可选：APW增菌液36℃±1℃2次增菌6h-8h36℃±1℃18-24h双洗平板TCBS平板弧菌显色平板36℃±1℃18-24hAPW增菌液36℃±1℃增菌6h-8h挑取可疑菌落5-10个，用霍乱弧菌O1/O139多价诊断血清进行玻片凝集O1群（小川和稻叶）及O139群霍乱弧菌的O1，O139菌体抗原及CTX基因的PCR检测上报市疾控进一步鉴定.2.操作步骤：2.1增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），放入碱性蛋白胨水（APW）培养基中36±1℃增菌6-8h。

2、2.2分离及二次增菌：增菌后从菌液生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划线接种于双洗平板，TCBS或弧菌显色平板。37℃培养18～24h后，选择单菌落做血清凝集实验。标本含菌量少时，为提高检出率，实行2次增菌，取第1次碱胨水增菌6h～8h的培养物的表层液0.1mL～0.2mL，接种于8mL～10mL的碱胨水中，37℃培养6h～8h再做分离。2.3血清学鉴定：从平板上挑取可疑菌落5-10个。双洗平板上为湿润、黑芯、光滑菌落。TCBS上为黄色发亮、表面光滑、稍凸起的菌落。弧菌显色平板上为蓝色，菌落中心略有凹陷的菌落（注意该平板上可疑菌落易发生自凝）。取少许培养物（TCBS和弧菌显色平板上的

3、疑似菌落需转种到营养琼脂小斜面或非选择性平板后进行血清学鉴定）与O1群+O139群霍乱多价诊断血作玻片凝集试验，如很快出现肉眼可见的明显凝集即为阳性反应，阳性者必须用生理盐水按同样方法作对照试验，以排除因自身凝集而导致的假阳性反应。并继续用小川和稻叶单价血清分型。对O1群不凝集的可疑菌落，再用O139群诊断血清作玻片凝集。2.4生化鉴定：在双洗平板、TCBS琼脂或弧菌显色平板上的疑似菌落转种在普通琼脂平板上，选取单菌落做生化初筛，选择单菌落做KIA和MIU实验。进一步生化鉴定选用梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化鉴定仪鉴定。具体操作按产品操作说明。2.5PC

4、R检测：可使用商品化的试剂盒或按照合成引物及探针后进行PCR检测。2.5.1O1和O139双重实时PCR验证检测，引物和探针序列见表1和表2：表2O1和O139双重实时荧光PCR检测的引物及探针引物名称核苷酸序列（5’～3’）产物长度（bp）O1FGGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG117O1RTAGAGACTCACCTTCGATTTCAGCO1PFAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1O139FCGATGGCGTGTTCATTAGAAGG104O139RTCCCTTTCCACCTCGGTATTTCO139PHEX-CGGCAAACTGGCAG

5、CAAACTCAGCA-BHQ1反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCRbuffer10μL,O1rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；O139rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水5.6μL，DNA模板2μL。循环条件为：95℃30s,95℃5s和60℃20s循环40次，在退火阶段检测荧光。2.5.2霍乱弧菌毒素基因（ctx）检测，见表2：表2ctx毒素基因的荧光PCR检测的引物及探针引物名称核苷酸序列（5’～3’）产物长度（bp）CT1FCTTCCCTCCAAG

6、CTCTATGCTC114CT1RTACATCGTAATAGGGGCTACAGAGCT1PFAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-BHQ1反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCRbuffer10μL,上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水6.8μL，DNA模板2μL。循环条件为：95℃30s,95℃5s和60℃20s循环40次，在退火阶段检测荧光。3.报告结果及上送菌种：报告粪便标本中检出霍乱弧菌，保存并上送菌种。二）沙门菌检测操作程序1．标本检测流程图：粪便或肛拭子挑取可疑菌落3-5个转种于初筛生

7、化管36℃±1℃18h-24hSBG增菌液36℃±1℃增菌18h-24h沙门菌显色培养基或SS平板36℃±1℃18h-24h对初筛生化符合沙门菌属的菌落进行血清学试验结果报告菌株保存2.操作步骤：2.1增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），放入SBG增菌培养基中36±1℃增菌18-24h。2.2分离：取增菌培养液一环接种沙门菌显色培养基上36±1℃培养过夜；2.3挑取可疑菌落：挑取可疑菌落（如科玛嘉沙门菌显色平板上，目标菌落紫色、淡紫色菌