定量分析方法ppt课件.ppt

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1、HPLC法高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography(HPLC)了解HPLC色谱仪的构成熟悉HPLC法分类及方法掌握HPLC法的定义、特点掌握HPLC法实验条件的选择掌握HPLC法的定量分析方法教学大纲用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。HPLC法的定义、特点一、定义二、特点1.适用范围广（可分析80%有机化合物）2.分离性能好3.分析速度快4.灵敏度高5.色谱柱可反复使用6.流出组分容易收集©200

2、6Baidu免责声明与百度对话HPLC实验条件的选择1.HPLC前处理2.色谱柱的选择3.流动相的选择4.洗脱方式的选择5.检测器的选择HPLC前处理1.流动相的处理2.样品的处理流动相的处理1.溶剂的纯化2.流动相脱气3.过滤4.色谱纯试剂5.重蒸水流动相的处理过滤：除去固体微粒亲水、亲脂、两用；0.45µm流动相的处理流动相脱气脱气：除去流动相中的空气方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热脱气、在线脱气系统样品的处理除去杂质、纯化样品浓缩样品或进行衍生化过滤HPLC前处理样品的处理供试品溶液的制备提取纯化浓缩or衍生化HPLC样品处方剂型待测成分的理化性质干

3、扰成分的理化性质色谱柱的选择根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度用途：制备型、分析型2-4.6mm;10-25cm色谱柱的长度与分离效果正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱，以正己烷系列为流动相。正相色谱法主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质色谱柱的分类反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机碳链。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。反相色谱法适用于非极性及中等极性化合物目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱最常用：（octadecylsilane)ODS柱/C18（十八烷基键合相）色谱柱的分类键合相的

4、优点①使用过程不流失②化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质③热稳定性好，一般在70℃以下稳定④载样量比硅胶约大一个数量级⑤适于作梯度洗脱避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱（如分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解）流动相要适宜，不能对固定相产生破坏注意色谱柱的pH使用范围、耐压限度注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲（除非指明）色谱柱的使用和维护每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗保存色谱柱在合适的溶剂中（应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对

5、禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。）色谱柱的使用和维护流动相的选择固定相一定时，流动相的种类、配比、pH值及添加剂等能显著影响分离效果，HPLC中流动相的选择至关重要。对流动相的基本要求①不与固定相发生化学反应②对样品有适宜的溶解度要求容量因子k在2～5(最佳)或1～10(可用)k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀③必须与检测器相适应例如用紫外检测器时避免末端吸收④粘度小容量因子(capacityfactory):也称为分配容量（partitionvolume）、容量比（capacityratio），是在达到分配平衡后，组分在固定相中的量与流动相中的量

6、之比。也称为质量分配系数。流动相的选择反相键合相色谱正相键合相色谱反相离子对色谱键合相色谱法：化学键合相为固定相的色谱法，分离机制以分配作用为主，对不封尾的键合相还有一定的吸附作用。应用最广泛的色谱法用化学反应将键合相的载体硅胶的残存硅醇基去掉的方法，称为封尾或遮盖（end-capping）,形成的键合相称为封尾键合相。反相键合相色谱流动相的选择1.部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃）适用于分离中等极性、弱极性药物常用甲醇－水、乙腈－水系统有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响反相键合相色谱流动相的选择2.缓

7、冲溶液常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组分的保留值注意由于C18链在水相环境中不易保持伸缩状态，故对于C18为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定反相键合相色谱流动相的选择3.非水溶剂流动相为不含水系统。用于分离疏水性物质。在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称