行业标准：DB37T 4038-2020 鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程.pdf

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1、ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T4038—2020鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程PreparationtechniqueofCpGoligonucleotideadjuvantforchickenvaccines2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布DB37/T4038—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、齐鲁师范学院、山东润达检测技术有限公司。本标准主要起草人：张琳、

2、吴家强、朱广伟、黄艳艳、于江、张玉玉、许传田、艾武、张秀美、刘军伟。IDB37/T4038—2020鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程1范围本标准规定了鸡特异性CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂的制备、检测、贮存等方面的技术规程。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1CpG寡脱氧核苷酸CpGoligonucleotide，CpGODN含有未甲基化的CpG二核苷酸

3、基序的核酸序列，能够在机体内诱导强烈的免疫反应。3.2硫代修饰phosphorthioatemodified将核酸序列磷酸二酯键中的非桥氧原子置换成硫原子，主要用于防止反义实验中核酸被核酸酶降解。3.3熔解温度meltingtemperature，Tm在DNA双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。3.4聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收、纯化目的DNA。3.5OD值opticaldensityvalue表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词

4、，检测单位用OD值表示。4试剂或材料1DB37/T4038—2020除另有规定外，所用试剂均为分析纯。4.1水：符合GB/T6682—2008一级水规定。4.2三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液：附录A.1。4.3生理盐水。4.4去内毒素质粒大提试剂盒。5仪器设备5.1微量移液器：2.5uL、10uL、200uL、1000uL。5.2高速离心机：离心力＞13000转/分钟。5.3无菌注射器：1mL、5mL。5.4冰箱：低于-20℃。5.5紫外分光光度计：波长范围200nm～380nm。5.6超净工作台或生物安全柜。5.7天平：精度0.1mg。5.8滤器：0.45um。5.9恒温摇床

5、：振荡频率10～400转/分钟，温度范围为室温～70℃。6佐剂的制备6.1单链形态佐剂的制备鸡种属特异性CpGODN序列：5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’，全链或两端硫代修饰，分子量6782.43g/mol，Tm值58.01。序列由生物公司合成，采用PAGE及以上纯化方式纯化，建议合成量20OD/管，分装2管。6.2双链形态佐剂的制备6.2.1重组质粒的构建6.2.1.1目的片段为含8拷贝鸡种属特异性CpGODN序列（同6.1）的基因片段。目的片段5’端添加SalI酶切位点（gtcgac），3’端添加XhoI酶切位点(ctcgag)，单拷贝序列间以碱基CTAGA连接。目

6、的片段和原核表达质粒pET21a分别经SalI和XhoI内切酶双酶切后，使用T4DNA连接酶进行重组连接。6.2.1.2将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在LB固体培养基（附录A.2）平板上37℃倒置培养约8～12小时后，挑取单克隆菌落至LB液体培养基（附录A.3）中，37℃条件下进行摇动过夜培养。6.2.2重组质粒的提取6.2.2.1用去内毒素质粒大提试剂盒进行重组质粒的提取。提取操作参照试剂盒说明书进行。6.2.2.2用0.45um的滤器过滤提取质粒，去除细菌、蛋白等杂质。纯净的双链重组质粒形态稳定，无需硫代修饰。7检测2DB37/T4038—20207.1单链形态合成产品取

7、一支CpGODN佐剂合成品(含10ODCpGODN)放入高速离心机，12000转/分钟离心3～5分钟，加水5mL，溶解混匀后取100uL，加入光径为1cm的石英比色杯，然后加入900uL水，混匀后用紫外分光光度计测定260nm处的数值，如为0.2证明CpGODN含量正常，如低于0.2说明CpGODN含量过低，合成量不足。7.2双链形态重组质粒取CpGODN重组质粒20uL，加入980uL水对质粒样品进行50倍