质粒电转操作规程.doc

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1、质粒电转操作规程文件名质粒电转操作规程文件编号编写人葛驾审核人批准人编写日期审核日期批准日期1.目的：制订武汉翰雄生物技术有限公司质粒电转操作规程以便规范开展质粒电转实验，获得准确、可靠的实验结果。2.依据：文献参考与根据实验条件探索。3.范围：适用于武汉翰雄生物技术有限公司质粒电转的操作指导。4.职责：参与质粒电转的实验人员对此规程的实施负责。5.内容：5.1设备及主要试剂5.1.1设备：5.1.1.1GenePulserXcell厂家：Bio-Rad序列号：617BR110565.1.1.2GenePulserCuvette厂家：Bio-Rad货号：16

2、5-2088规格：4mm5.1.1.3移液枪20-200ul厂家：大龙（国产）编号：YE3K5.1.1.4移液枪100-1000ul厂家：大龙（国产）编号：YE3K5.1.1.5STRIPETTE移液管厂家：CORNINGCOSTAR规格：5ml5.1.1.61.5mlEP管厂家：AXYGEN编号：311-08-0515.1.1.725cm2CellCultureFlask厂家：CORNINGCOSTAR货号：5.1.1.8AcrodiscSyringeFilters厂家：PallCorporation批号：规格：直径25mm0.2μm5.1.1.9超净工作

3、台5.1.2试剂：无水乙醇（0.2μm过滤）批号：3M乙酸钠（0.2μm过滤）批号：70%乙醇（0.2μm过滤）批号：灭菌注射用水厂家：裕松源药业批号：规格：5ml质粒(以pcEFGP为例)溶液批号：浓度：416ug/ml体积：1mlCHO-K1细胞批号：密度：2.1x10^6/ml体积：5mlCDOptiCHO培养基厂家：GibcoREF：12681-011Lot.：5.2实验过程(以质粒pcEFGP电转为例)5.2.1质粒pcEFGP的准备：5.2.1.1取已提取好的质粒pcEFGP溶液（，416ug/ml,1ml）分装至2只EP管中，500ul/管。5

4、.2.1.2每管加入2倍体积的无水乙醇（1ml）、1/10体积乙酸钠，混匀后置于4℃冰箱过夜沉淀。5.2.1.3次日取过夜沉淀的两pcEFGP，9500g，离心30min。5.2.1.4弃上清，每管加入500ul，70%的乙醇，震荡混匀后，9500g，离心5min。5.2.1.5弃上清，金属浴中55℃烘干20min。5.2.1.6每管加150ul的无菌注射用水溶解，混匀后用超微量紫外分光光度计测浓度。5.2.1.7测得结果：C（ug/ml）A260/280A260/230标签pcEFGP-111621.912.26pcEFGP-1，乙醇沉淀，1162ug/m

5、l，pcEFGP-210871.902.29pcEFGP-2，乙醇沉淀，1087ug/ml，备注：以上操作皆于超净工作台完成。5.2.2电转前准备：5.2.2.1把相关实验用品放入超净工作台，紫外灭菌30min。5.2.2.2准备CDOptiCHO培养基（含&不含6mMGln）适量。5.2.3电转操作：5.2.3.1先取样计数得CHO-K1细胞浓度为2.1x10^6/ml，再取适量CHO-K1细胞200g转速，离心5min。5.2.3.2弃上清，加入不含Gln的CDOptiCHO培养基5ml，200g，离心5min。5.2.3.3重复上一步骤5.2.3.2。

6、5.2.3.4弃上清，加入2ml不含Gln的CDOptiCHO培养基，重悬计数。5.2.3.5根据计数结果，调整细胞悬液浓度为5x10^6/ml。5.2.3.6取800ul细胞悬液于一EP管内，加入50ug（43ul）质粒pcEFGP-1，充分混匀后，室温静置15min。同时将电击杯放入4℃冰箱预冷15min。5.2.3.7将细胞与质粒混悬液加入电击杯中，设置电转仪参数（指数波300V，900uF，22.5ms）进行电转。5.2.3.8将电转后细胞与质粒混悬液上产生的泡沫及成团死细胞吸除后，迅速转至5ml含Gln的CDOptiCHO培养基中。5.2.3.9放

7、37℃，5%CO2培养箱中孵育12--14天并观察细胞活性。质粒质粒浓度质粒取样量细胞细胞密度取样量电转条件pcEFGP1162ug/ml50ug(42ul)CHO-K15x10^6/ml800ul指数波300V，900uF，22.5ms5.3注意事项：5.3.1实验全过程注意无菌操作，避免染菌。5.3.2电转杯要预冷至4℃使用。