一种铁皮石斛人工种子制作方法

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1、一种铁皮石斛人工种子制作方法,其特征在于具体步骤如下：(1)种子无菌萌发选取铁皮石斛成熟未开裂蒴果,自来水冲洗表面污渍5min,在超净工作台中,用70％酒精棉球擦拭果壳表面沟纹,然后将整个蒴果放入在0.1％升汞溶液中灭菌15-25min,无菌水冲洗4-5次,吸干表面水分。在超净工作台上,将果实用消毒后手术刀切开,用接种针将粉末状胚接种到种子萌发培养基表面,接种两周后,种子萌发形成原球茎,从而建立原球茎诱导体系。(2)原球茎增殖将种子萌发的原球茎接种于增殖培养基中进行培养,接种量,以鲜重计,每瓶3g,原球茎增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+0.2mg/LNAA,每升

2、培养基添加50-100ml椰子汁和10-20g纳米TiO2。上述步骤(1)-(2)中培养基pH值为5.4-5.6,培养温度(25±2)℃,光照强度2000lx/10h。(3)铁皮石斛人工种子制作将增殖后的原球茎,转入含有0.5mg/LABA的MS培养液内振摇培养(100r/min),每10d更换培养液1次。30d后用6目尼龙网筛选择长×宽约为(0.5-1.5mm×2.0-3.4mm)原球茎作为包埋繁殖体。以MS+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.3％AC+3％海藻酸钠+0.3％百菌清为基本人工胚乳,在此基础上添加1.5-2.0％的淀粉、1.0-2.0％的保

3、水剂和1.0-3.0％的纳米TiO2,以海藻酸钠为人工种皮基质(用CaCl2固化)。用蒸馏水配制2％的CaCl2,经高压灭菌,冷却备用。采用滴注法,在超净台上,将原球茎浸入含有海藻酸钠的人工胚乳中,5min后用吸管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到添加2％壳聚糖和1.0-3.0％纳米TiO2的2％CaCl2溶液中,确保每颗人工种子只包裹一个原球茎。在CaCl2溶液中经过15min的离子交换,自动固化成粒,取出用蒸馏水冲洗干净,置于滤纸上吸去表面水分,获得铁皮石斛人工种子。(4)人工种子萌发在不同的萌发基质上进行萌发试验,萌发基质分别为：纯琼脂培养基、MS培养基、复合

4、基质(无菌)、复合基质(有菌),复合基质为砂土∶锯末＝1∶3(基质先经KMnO4和甲醛熏蒸消毒,密封5天后敞开散尽甲醛蒸汽)。相同条件下制作的人工种子在不同萌发基质中的萌发率和成苗率也有较明显的差异,在MS琼脂培养基的萌发基质上,人工种子的萌发率、成苗率最高,其次是纯琼脂培养基,然后是复合基质(无菌萌发),复合基质(有菌萌发)。在人工种子制作中添加纳米材料可阻止营养成分的外泄,并能增强铁皮石斛人工种子抗菌能力,从而提高人工种子在有菌条件下的萌发率。(5)人工种子贮藏将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中,用封口膜封好,在4℃下分别贮藏30d和60d。