行业标准：DB12∕T 956-2020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法.pdf

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1、ICS65.020.30B43DB12天津市地方标准DB12/T956—2020奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法Determinationoftotalcoliforms,fecalcoliformsandEscherichiaColiindairyfarmmanure–Enzymesubstratemethod2020-08-18发布2020-10-01实施天津市市场监督管理委员会发布DB12/T956—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：农业农村部环

2、境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所。本标准主要起草人：赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨。1DB12/T956—2020奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法1范围本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技术要求及操作方法。本标准适用于规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的同时测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

3、改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27522—2011畜禽养殖污水采样技术规范HJ1001—2018水质总大肠菌群，粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定酶底物法3术语和定义HJ1001—2018界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便使用，以下重复列出了HJ1001—2018中的某些术语和定义。3.1总大肠菌群和粪大肠菌群totalcoliformsandfecalcoliforms奶牛场粪污中常见的肠杆菌科细菌，恒温（总大肠菌群：37℃；粪大肠菌群：44.5℃）培养后可分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖

4、苷（ONPG）生成黄色邻硝基苯酚。3.2大肠埃希氏菌EscherichiaColi俗称大肠杆菌，恒温37℃培养后既能够分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚，同时可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365nm紫外光源照射下显蓝色。[HJ1001—2018，定义3.3]3.3最大可能数mostprobablenumber（MPN）一种基于泊松分布的间接计数方法。根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在数量。[HJ1001—2018，定义

5、3.4]4粪污样品采集2DB12/T956—20204.1采样物品采样容器应使用一次性无菌容器，或经121℃、20min高压灭菌处理。其余采样工具、文具、器具、防护用品按照GB/T27522—2011中第4.1款规定执行。4.2采样方法按照GB/T27522—2011中第4.4.2款的规定执行。4.3样品保存采样后应在低温（4℃）条件下保存并在6h内完成测定。5酶底物测定5.1方法原理在选择性培养基中培养18h～24h，总大肠菌群和粪大肠菌群能够产生β-半乳糖苷酶并分解培养底物中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚（ONP），该物质在白光或日

6、光照射下显黄色。大肠埃希氏菌可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365nm紫外光源照射下显蓝色。计数97孔板中阳性单元格出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的浓度值。5.2试剂材料5.2.1分析时应使用符合GB/T6682—2008中三级水规定要求的实验用水，并经121℃、20min高压灭菌后使用。5.2.2培养基宜采用HJ1001—2018中第6.1款规定的MinimalMediumONPG-MUG培养基。每100mL预处理后的样品应使用培养基粉末2.7g±0.5g，培养基可采用市售商品

7、化培养基制品，成分见表1。表1培养基成分表单位为毫克名称数量硫酸铵[（NH4）2SO4]500硫酸锰（MnSO4）0.05硫酸锌（ZnSO4）0.05硫酸镁（MgSO4）10氯化钠（NaCl）1000氯化钙（CaCl2）5亚硫酸钠（Na2SO3）4两性霉素B（AmphotericinB）0.1邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）504-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5茄属植物萃取物（Solanium萃取物）50N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES钠盐）530N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）6903DB12/T95

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