SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.pdf

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1、项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量一实训目的1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成S

2、DS-蛋白质负4离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X10～416.5X10之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。LogMW＝K－bm(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.三、实训器材序号设备名称规格，型号数量1垂直板电泳槽及附件12直流稳压稳流电泳仪可变压13微量进样器24玻璃注射器15玻璃平板46电炉1序试剂纯度、浓度作用配制需要工具需要工

3、具号方法1低分子量标2mg/ml以标准样品为见表水浴锅、小烧准蛋白质样对照即可确定格下杯，玻璃棒本样品各区带的方成分2样10~20mg/ml作为实验组来同上水浴锅、小烧品测定蛋白质的杯，玻璃棒分子量3浓缩胶缓冲呈弱酸性，使甘同上天平、容量液氨酸解离很少，瓶、棕色试剂在电场作用下，瓶涌动效率低，二氯离子含量高，形成较高的电位梯度压着蛋白质聚集在一起，凝缩为一狭小区带。4分离胶缓冲呈碱性，甘氨酸同上天平、容量液解离度大，涌动瓶、棕色试剂速率增加，紧随瓶氯离子之后，在电场作用下，蛋白质根据其固有的电性得到分离。5电极缓冲液保证电泳的同上1000ml的容PH，起传播电流量瓶、天平作用

4、6过硫酸铵1%作为催化剂，产同上天平、容量瓶（AP）生自由基，加速凝胶聚合。7SDS1%去掉其电荷效同上天平、100ml应，使样品的蛋容量瓶白质分子的迁移率完全取决于分子量8样品缓冲液同上天平、100ml容量瓶9样本变性液使蛋白质变性，同上天平、100ml固定在凝胶上容量瓶10固定液使蛋白质固定同上天平、100ml在凝胶上，便于容量瓶后续过程中色普带的确定11染色液同上天平、100ml容量瓶12脱色液脱去凝胶上的同上天平、100ml染色液，使蛋白容量瓶质谱带清晰13保存液保存凝胶，便于同上天平、100ml下次使用容量瓶14指示染料液便于观察蛋白同上天平、100ml质在凝胶电泳

5、容量瓶中的位置，有利于调节电流15TEMED加速剂，可催化同上天平、100ml过硫酸铵产生容量瓶自由基，从而加速丙烯酰胺的聚合配制方法1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1molHCl，加水混匀定容至25毫升。2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1molHCl，加水混匀定容至100毫升。3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。5、样本缓冲液(Tris-HClpH6.8I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。6、

6、样本变性液(Tris-HClpH6.8I=0.01M，2％SDS，10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS，4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。或25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤纸过滤。9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。10、保存液：10％乙醇-1

7、0％醋酸-10％甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加水混匀定容至1000毫升。11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。四、实训步骤（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳1.电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。2.样品处理：将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。3.制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5％的分离胶，（为小孔胶，进