电泳简单介绍ppt课件.pptx

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1、我们毕业啦其实是答辩的标题地方电泳的介绍带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。“”基本原理”“电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分

2、子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电源电泳槽样品处理制胶跑胶固定染色电泳的流程脱色WB8%、10%、12.5%、15%的胶16.5%的Tricine胶4-20%的梯度胶ECL反应曝光123SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，变性条件下电泳，根据蛋白质亚基分子量的不同来分开蛋白质。SDS-PAGE等电聚焦电泳利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。IEF毛细管电泳CE分类电泳在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用，考马斯亮蓝灵敏度每条带0.1-1ug

3、；还有灵敏度较高的银染。染色蛋白质印迹法（免疫印迹试验）通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质分子样品进行着色。WB处理方式SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关;制胶缓冲液:选择Tris-HCl系统，浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，TEMED与AP:AP催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用;十二烷基磺酸钠(SDS):阴离子去污剂，作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去除多肽折叠。SD

4、S-PAGE制胶工具预制胶根据样品分离目的不同，主要有两种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理。SDS-PAGE12还原SDS处理:在上样buffer中加入β-巯基乙醇（β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂），蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子。非还原SDS处理:未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的分离胶浓度(%)15~45kDa1515~60kDa12.518~75kDa1030~120kDa8预制胶4-20%分子量范围10~250kDaSDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一

5、定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。SDS-PAGEIEF等电聚焦就是在电泳凝胶中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极

6、到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上。IEF等电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开。一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄。由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离，可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。等电聚焦的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质

7、。.免疫印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性