沈萍微生物原版PPT 第10章课件.ppt

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1、第9章微生物基因表达的调控生物技术系陈向东自学！第9章微生物基因表达的调控第10章微生物与基因工程生物技术系陈向东是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程（geneticengineering）或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。（参见P255）微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代

2、的作用！（参见P255）“微生物与基因工程”克隆技术是所向披靡的“六脉神剑”还是危机四伏的“潘多拉盒”99药学--------99生物基地班一、基因工程的基本过程1.基因分离：（参见P256）a）分别提取供体DNA和载体DNA2.体外重组b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和载体连接，成为重组载体。3.重组载体的传递与筛选用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子.第一节基因工程概述4.在特定的宿主中表达,得到基

3、因工程产品二、基因工程的发展历史对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：DNA的特异切割DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）DNA的快速测序聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）DNA合成技术DNA的定位诱变技术（参见P255）三、微生物学与基因工程的关系1）基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬菌体改造而成；2）基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；3）将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转化现象的基础上发展起来的；4）微生物细胞是基因克隆的重要宿主，5）微生物是基因产物的重要表达载

4、体；6）基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对微生物的研究；7）微生物的多样性，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术（参见P256）第二节微生物与基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restritionenzyme）。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制

5、–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。（参见P264）1.命名与分类取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoRI表示大肠杆菌属名第一个字母E：表示种名头两个字母co：表示株名R：表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型I型和III型限制酶无切割特异性或特异性不强II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附

6、近，特异性最强。2.限制性核酸内切酶的基本特性识别序列通常由4～8个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromicstructure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端HindIII的识别序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成5或3单链突出的粘性末端的DNA限制片段。二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以

7、通过碱基的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。HpaI的识别序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链。具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的作用连接起来不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。3.同裂酶（Is

8、oschizomers）有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可