基于猝灭荧光素的一种TCSPC仪器响应函数测量方法-论文.pdf

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1、第34卷，第8期光谱学与光谱分析Vo1．34，No．8，pp2284—22882014年8月SpectroscopyandSpectralAnalysisAugust，2014基于猝灭荧光素的一种TCSPC仪器响应函数测量方法潘海峰，丁晶新，梁荣荣，陶占东，刘梦薇，张三军，徐建华华东师范大学，精密光谱科学与技术国家重点实验室，上海200062摘要根据荧光物质的动态猝灭作用原理，将碘化钠饱和水溶液与碱性荧光素水溶液按照特定的比例混合，利用时间分辨设备测量猝灭后的荧光素荧光寿命。实验观察到随着碘化钠饱和溶液浓度的增加，测量得到的荧光寿命逐步从4ns减小至24ps左右。如将猝灭荧光素作为仪器

2、响应函数的标准样品，与通常作为标准样品的二氧化硅纳米颗粒悬浮液进行对比，实验结果显示两者非常吻合，表明猝灭荧光素可以作为荧光衰减测试中的标准样品，进一步研究发现这种新的标准样品一方面避免了传统测量手段中需要在不同探测波长反复测量仪器时间响应函数的问题，更有效地减小了实验中颜色效应造成的实验误差。有望在时间分辨荧光光谱和荧光寿命成像等研究中得到应用。关键词时间分辨荧光光谱；荧光素；碰撞猝灭；仪器响应函数中图分类号：0433文献标识码：ADOI：10．3964／j．issn．1000—0593(2014)08—2284—05叠区域等优点，被广泛应用在荧光光谱领域中l2]。除此之引言外，荧光

3、素在水中有相对较高的溶解度且对所处环境酸碱性(pH值)十分敏感[4]，这些特性都使得荧光素成为研究共振时间分辨荧光技术被广泛应用在生物化学以及生物物理能量转移的理想有机染料l5]。鉴于荧光素应用的广泛性，将等领域。仪器响应函数(instrumentresponsefunction，IRF)饱和荧光素水溶液用碘元素猝灭后作为测量IRF的参考试在时间分辨荧光光谱测量的各项参数中具有至关重要的地剂，将对时间分辨荧光光谱的研究具有十分重要的作用。通位，实验中测得的荧光衰减曲线是仪器响应函数和真实的荧过碰撞猝灭荧光素的方法来测量绿一黄可见波段的IRF，不仅光衰减曲线的卷积。因此，IRF将直接影响

4、到实验结果的测仅局限于用TCSPC技术测量的方法，进一步采用了具有飞量准确性。通常IRF是通过测量激发光的时域剖面图来获得秒量级时间分辨率的频率上转换荧光光谱测量系统来探测荧的，瑞利光散射为这一测量提供了足够强度的信号。然而，光素猝灭后的真实荧光寿命_6]。将猝灭荧光素作为IRF的参这种方式的缺陷在于：只能将探测波长定位在靠近激发波长考染料，实验结果与二氧化硅纳米颗粒悬浮液作为参考染料位置处进行信号的探测。而传统的探测仪器，如单色仪、光非常吻合。电倍增管(PMTs)和雪崩光电二极管(APDs)都存在着颜色效应u]，这将导致时间分辨测量的结果出现系统误差。因1原理此，如果能够在荧光发射波

5、段来测量IRF，将能提高整个实验结果的准确性，并且避免了更换滤波片的麻烦。类似于稳1．1荧光猝灭原理态激发光谱，时间分辨激发光谱在研究材料的性质方面具有碰撞猝灭可以将荧光团寿命有效减小至皮秒量级。它的重要的应用。时间分辨激发光谱需要测量在不同波长激发下猝灭机制是处于激发态的荧光团与溶液中的猝灭剂发生碰撞同一发射波长的荧光的时间衰减曲线，采用散射样品测量导致荧光强度的减弱l7]。遵循Stern-Volmer方程]IRF的方法会导致不同激发波长具有颜色效应，影响测量结Fi1"0—1+T0[翻一l+KD[Q](1)果的准确性。1荧光素是一种常见的具有光致荧光特性的染料，因其具其中，F0和F分

6、别是无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度，。备消光系数高、量子产率大、以及吸收和发射带存在大量重是生物分子猝灭常数，是不存在猝灭剂时的荧光团寿命，收稿日期：2013-07—18。修订日期：2013—10—15基金项目：上海市教委晨光项目(11CA~24)，中央高校基本科研业务费专项资金项目资助作者简介：潘海峰，1981年生，华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室高级工程师e-mail：hfpan@phy．ecnu．edu．Crl*通讯联系人e-mail：sjzhang@phy．ecnu．edu．CI第8期光谱学与光谱分析2285[Q]是猝灭剂浓度，Ko是Stern-Volmer猝灭常数

7、。利用碘元素将饱和荧光素水溶液的荧光发射寿命猝灭至皮秒量级，使其能够应用于TCSPC中IRF的参考染料。除了本文所提到的荧光素，此前被用作参考染料的还有罗丹明6G和玫瑰红l9。本研究的荧光素发射波长在绿光波段范围，目的是匹配绿色荧光蛋白(GFP)这种重要研究对象的的荧光发射波长，为研究其时间相关激发谱提供有力的实验途径。Fig,．2Sketchoffemtosecond-resolvedfluorescence1．2时间相关单光子计数法原理fr