生物化学和分子生物学3.ppt

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1、重组DNA技术生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命工业革命解放人的双手第二次技术革命信息技术扩展人的大脑第三次技术革命生物技术改造生命本身基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分

2、子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术生物技术的主要内容基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学

3、和细胞生物学实验实施的基础。现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不

4、同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别

5、使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。基因工程的应用重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）克隆:目的基因与载体连接，形成重组的DNA分子；（3）转化：用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）筛选：对转化子筛选和鉴定；（5）大量培养：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组的基本模式分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）“纵向”体系目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线(分)------目的基因及载体的分离获得需要的目的基

6、因常用的方法：（1）化学合成（2）基因组文库(genomicDNAlibrary)（3）cDNA文库（4）聚合酶链式反应（PCR）化学合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp）多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序相应的基因结构化学合成目的基因化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。化学

7、合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。用途：PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针基因组文库细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。基因组文库基因组文库是含有某种生物全部基因片断的DNA克隆群体。直接从生物体中提取总DNA，用超声或酶处理，将染色体DNA切割成片断，插入载体，转入受体菌扩增，得到基因组DNA文库，从中调用目的基因；缺点:结构基因只含基因组很小一部分，有重复序列，假基因。真核生物基因组有