基于测序的微生物多样性分析总结.docx

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1、基于二代高通量测序的环境微生物多样性分析一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究，而变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发现困难等因素无法达到深入分析环境微生物多样性的目的。高通量测序技术的出现，极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。微生物群落中物种的多样性依然是目前研究的重点。对群落结构的研究，将有助于了解种群结构的稳

2、定性，进而了解种群内物种间的相互依赖、相互制约的内在联系，为将来构建功能性种群服务。鉴于微生物群落是一个多物种的集合体，其中高达95%以上的微生物物种无法分离也不能独立培养，拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现，细菌16S或真菌ITS测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石。一、高通量测序背景介绍高通量测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对PCR扩增产物直接进行序列测定成为可能。极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前高通量测序

3、的主要平台代表有Illumina公司的Solexa基因组分析仪（IlluminaGenomeAnalyzer）、罗氏公司(Roche)的454测序仪（RochGSFLXsequencer）和ABI的SOLiD测序仪（ABISOLiDsequencer）。微生物多样性分析中，以Illumina及454测序平台应用最为广泛。二、工作流程1PCR引物的设计2PCR扩增条件摸索3琼脂糖凝胶电泳检测结果4全部样品进行PCR5PCR产物的凝胶回收及检测6PCR产物精确定量（Qubit2.0）将纯化后的PCR产物采用微量荧光核酸定量仪进行精确定量

4、（精确到0.1ng/ul）7.将定量后混匀的DNA样本再次进行磁珠法纯化后，进行高通量测序三、可分析项目1)有效序列数据统计在测序实验中，通常采用多个样品平行测序的方法，即多个样品混合测序。为了能区分样品，各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的barcode标签序列。若所测序列中不含有barcode标签序列，则无法确定其样本来源，进而导致后续生物信息错误或意义不明。因此，仅当原始序列中含有完整的barcode标签序列时，该条序列才被认可为有效序列。2）优化序列数据统计通常情况下，有效序列可以直接用于后续生物信息学分析。在实验

5、过程中，测序产物可能含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息可以将其去除；序列中可能含有模糊碱基（ambiguous）、单碱基高重复区（homologous）以，长度过短的序列(序列长度小于200bp)，及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此修剪、去除（trim）此部分序列，可得到供精准分析的优化序列。在数据去除（trim）时，把maxambig=0，axhomop=8，maxlength=200，及其嵌合体序列去掉，并对数据进行统计，得到优化序列的百分率。3)OTU生成根据序列的相似性，将序列归

6、为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。OTU（OperationalTaxonomicUnits）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在生物信息分析中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据客户指定的相似度（96%、97%或者98%），对所有序列进行OTU划分并进行生物信息统

7、计分析。OTU分析主要步骤(1)提取非重复序列，碱基完全一致序列为重复序列；(2)与silva库中的aligned(16S/18S,SSU)核糖体序列比对；(3)Chimeric序列检测与去除(4)距离计算与OTU聚类。4)多样性分析（Alpha-diversity）计算菌群丰度（Communityrichness）的指数有：（1）Chao：是用chao1算法估计群落中含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao(1984)最早提出。（2）Ace：用来估计群落中含有OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学

8、中估计物种总数的常用指数之一，与ChaoI的算法不同。计算菌群多样性（Communitydiversity）的指数有：（1）Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由EdwardHughSimpson(1949)提出，在