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《植物病原真菌侵染过程的组织病理学观察.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、一、目的要求学习组织整体透明染色技术和荧光染色技术，观察病菌在组织屮的扩展过稈和主要组织病理学特点，以增强学生对病原真菌侵染过程的了解。二、基本原理病原真菌侵染过稈的组织病理学观察常用组织報体透明染色技术和荧光染色技术。组织報体透明的常用方法包括水合氯醛透明、甘油乳酸液水合氯醛透明、乳酸透明和毗碇透明等方法。1.水合氯醒透明将小块组织在等量的酒精（95%）和冰醋酸混合液屮固定24h,然后浸在饱和的水合氯醛水溶液屮。待组织透明后取出用水洗净，经稀苯胺蓝的水溶液染色后，用甘油浮载镜检。2.廿油乳酸液水合
2、氯醛透明将小块标木或切片放在酒精和冰醋酸的混合液中固定,待叶绿索褪去后,标木移在载玻片上；加含有1%酸性品红的什油乳酸液儿滴染色，徐徐加热到发烟为止。然麻,除去残余的什油乳酸液，加儿滴不含染料的林油孔酸液（并加热），洗去多余的染料,移在水合氯醛的饱和溶液屮，组织透明后即可检视。如要永久保存，可以用水合氯醛的饱和溶液作浮载剂,用贴金胶水或磁漆等封固。3.乳酸透明病组织在乳酸（75%）屮浸儿天示即透明，组织屮有颜色的菌丝体和了实体祁可以看到。病菌结构如果是无色的,可用加0.5%-1.0%苯胶蓝的林油乳酸
3、液染色屮检视。4.毗旋透明小块叶片浸在I此呢屮，很快即可褪色和透明，经过水洗或者削妾放在什油乳酸液屮检视。组织報体透明染色技术常用于在组织和细胞水平观察病菌的扩展过稈。该法适于进行组织屮病菌菌丝扩展的定量研究,可以揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤。荧光染色技术则能克服这一缺点，能更准确、快速地观察组织屮病菌菌丝的扩展情况。组织荧光染色技术是研究病菌与其寄主Z间相互关系的较为理想的方法。三、材料、试剂与仪器1.小麦品种和锈菌菌种供试品种由锈菌生理小种鉴别
4、品种屮或当地栽培品种屮选取。试验菌种可以是小麦三种锈菌（秤锈菌、叶锈菌、条锈菌）屮的任何一种。供试生理小种应能使各供试品种分别表现0,1,2,3〜4等各级反应型。用所选小种的新鲜夏饱子作接种体。2仪器与用具小花盆、毛笔、手持喷雾器、保湿筒（箱），单刃刀片、银了、烧杯（50ml）.滴瓶、酒精灯、三角架、石棉网、载玻片、盖玻片、测微尺、普通显微镜、荧光显微镜等。3.试剂50%和95%乙醇、棉蓝乳酚液（乳酚油配方为:乳酸20mk苯酚20mk20%甘油40ml、蒸镭水20ml。乳酚油中加入0.05-0.1%
5、棉蓝）、25%和50%甘油液、水合氯醛、滑石粉、甲醉、氯仿、Tris-HCl缓冲液（pH8.5,0.1mol/L）＞固定透明液（乳酚油:95%乙醇=1：2）、NaOH（0.5mol/L）.calcoHuorwhite（0.1%）等。四、实验步骤｛一｝组织報体透明染色观察1.植物材料培育和接种供试小麦品种饱满种了播于小花盆屮，在16〜20°C和口照12〜16h的条件下育苗。幼苗第1叶片展平后接种。接种叶片用手指蘸水轻抹去叶表血的蜡粉（去蜡），用手指醮取条锈菌新鲜夏沦了涂抹在叶片上接种,然后用手持喷雾器
6、向接种叶片上喷水雾。再将花盆移入盛水的保湿筒内保湿12〜24h后取出，培育（16〜18°C,光照16h,光强不低于lOOOOIx）。2.取样和处理分别在接种后12h、24h、72h和96h取样。每次每品种摘取3个接种叶片，用单刃刀片将接种叶片切成2cm长的叶段，叶段的上表皮朝上，从顶部由左下方向右上方斜切成楔形，以便于透明，染色后区分叶片上、下表曲。将叶段置入95%乙醉和棉蓝乳酚液等量混合液屮,在酒精灯上加热煮沸1.5min,然后在室温下静置48h；取出叶段用蒸镭水漂洗2次；将洗涤后的叶段置入水合氯
7、醛饱和溶液（一般按5g水合氯醛加2ml蒸锚水的比例)屮30〜50min(也可长时间放置)或用小火加热数分钟，但勿使溶液沸腾。取出叶段用清水漂洗后置于载玻片上，用50%甘油液作浮载剂制片。1.样片检杳和记载样片用显微镜镜检并进行显微计测。各品种每次取样的材料至少检查30个单个夏砲子侵入形成的侵染点。检查和记载的项目有：(1)吸器母细胞。统计各侵染点屮吸器母细胞数目,计算平均数。(2)菌落线性长度。用测微尺测定菌落线性长度，该长度指菌落两端最远处的侵染菌丝顶端之间的頁线距离。若小菌落只在一侧产生侵染菌丝
8、，则计测由气孔下囊至最长菌丝顶端间的真线距离。若不用测微尺测量，则可以气孔长度为单位，估计菌落线性长度相当于气孔长度的倍数。4反应型记载各品种均保留部分接种苗，在接种后12~14d,已充分发病，反应型正常时,按常规分级标准，记载反应型级别。(二)荧光染色观察1.接种将锈菌夏袒了与滑石粉按1:10比例混匀，用毛笔将他子粉涂抹于未脱蜡的麦叶表皮上，然后按常规方法保湿24ho2.取样经保湿后即可取样,具体时间因观察内容而定。⑴将所取叶片切成2cm的叶段，放入甲醇一氯仿(1:
