凝胶层析实验步骤及细节.doc

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1、温州大学第四届生物学科实验技能大赛血清凝胶层析实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告实验时间：5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具实验后：清理实验器具凝胶层析的实验步骤凝胶层析的实验步骤过程名称实验步骤凝胶预处理8g葡萄糖胶G-25放入250mL烧杯中100mL蒸馏水（充分溶胀）小火煮沸1h（水快没了就再加水）小心搅拌（不破坏凝胶的结构）静止、冷却、倾弃蒸馏水加入PBS磷酸盐缓冲液10mL轻轻搅拌至凝胶

2、悬起倾入10×1.0cm层析柱装柱   将全部凝胶一次性都倾入柱内（防止断层），且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。每分钟4滴水出来（2/3）（防止压得太紧）加样   用胶头吸管将柱中上方清液吸出，沿柱内壁缓缓滴加重铬酸钾（黄色）和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。均匀加样（4滴）洗脱   用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到6～7dpm（实际10～15dpm）。收集蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。收集3ml的试管一

3、个个放好，最后完全白色才结束实验。再生（不断加蒸馏水洗涤）实验试剂和用品1.试剂Sephandex4B凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水2.主要实验用具铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒凝胶层析定义凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利

4、用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。实验原理不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶

5、过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。凝胶柱的制备在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千

6、万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干

7、燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。