Ni柱子使用简介.doc

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1、NiSepharose6FastFlow柱子使用简介一、相关参数结合能力：Approx.40mg(His)6-taggedprotein/mlmedium建议流速：2ml/min（恒流泵旋钮调到1.40）二、缓冲液（使用前用0.45μmfilter过滤）Bindingbuffer:20mM磷酸钠sodiumphosphate,0.5MNaCl,20–50mM咪唑imidazole,pH7.4（一般用磷酸缓冲液；也可以用Tris-HCl,但是metal-proteinaffinity很弱则不适宜；缓冲液中避免添加EDTAorcitrate等鳌合剂）E

2、lutionbuffer:20mMsodiumphosphate,0.5MNaCl,500mMimidazole,pH7.4（咪唑浓度40mM—500mM优化）当His-taggedproteins是包含体，在所有的buffer中includeupto6MGua-HClor8Murea。加了urea的样品可以直接用SDS-PAGE检测；Gua-HCl样品必须用含urea的buffer置换，再进行SDS-PAGE检测。三、样品加入的咪唑浓度等同bindingbuffer中的。四、ColumnpackingNi柱子的beads浸泡在20%ethan

3、ol中，倾除20%ethanol溶液，用蒸馏水将beats调成75%（v/v）的浓浆状的凝胶。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，静置。五、purification步骤1、5CV(柱体积，即10ml)的蒸馏水洗20%酒精浸泡的柱子，线性流速2—3ml/min；（建议恒流2ml/min=恒流泵调到1.40，洗5min）；2、用9CVbindingbuffer平衡柱子，线性流速为5ml/min；(建议横流3ml/min=恒流泵调到1.80，洗6min)；3、加样品，一般过3次柱子，恒流3ml/min=恒流泵调到1.80；4、用5CV的bindingbuffer洗

4、杂蛋白（咪唑浓度要优化），恒流泵调到1.40，洗5min5、用4ml的elutionbuffer洗目的蛋白，不要恒流泵，让其自流；（若用梯度浓度洗，则用20CV=40ml）注：新换了Ni2+，避免渗漏，建议Blankrun:结合/洗脱buffer不能含有缓冲液1.用5CV的蒸馏水洗柱子；2.用5CVbindingbuffer洗柱子；3.用5CV的elutionbuffer洗；4、用10CV的bindingbuffer的平衡柱子。六、重生柱子如果是两次纯化是同一个蛋白，不必要用NiCl重生，使用蒸馏水或bindingbuffer交替洗柱子3—5次，每

5、次5cv。纯化5次之后的柱子要用NiCl重生1、除残留Ni2+：5CV的20Mm磷酸钠缓冲液,0.5MNaCl,50mMEDTA,pH7.4.2、除残留的EDTA：5—7CV的bindingbuffer3、5CV的蒸馏水4、0.5CV的0.1MNiSO4过柱子5、5CV的蒸馏水洗6、5CV的bindingbuffer7、20%的酒精中浸泡注：柱子不用的时，NiSepharose6FastFlow不能浸泡在含有还原剂的溶液中