大肠杆菌计数.ppt

《大肠杆菌计数.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、大肠杆菌计数严纪文广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气、IMViC生化试验(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)为++--或-+--的革兰阴性杆菌。大肠杆菌的定义大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年。为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂。大肠杆菌是用于评价食品近期受到粪便污染的指标。随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越

2、来越多，因此在本次标准修订时增加了大肠杆菌计数方法。卫生学意义大肠杆菌计数第一法：MPN法第二法：VRBA-MUG平板计数法第三法：Petrifilm测试片法第一法大肠杆菌计数MPN法大肠杆菌计数MPN法检验程序检样25g(ml)+225ml稀释液，均质10倍稀释选择3个连续稀释度样品匀液接种LST48±2h36℃±1℃不产气产气EC肉汤45℃±0.2℃24±2h不产气产气EMB琼脂平板36℃±1℃24±2h营养琼脂斜面培养IMViC生化试验，革兰染色查MPN表，报告初发酵选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超

3、过1mL，则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养48h±2h，如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。复发酵如有产气者，则转接到已提前预温至45℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放于带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。分离培养与纯化如有产气者，则分别划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36℃±1℃培养24h±2h后检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。挑选典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，进行进一步的

4、纯化分离。生化鉴定取培养物进行革兰氏染色和生化试验。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。查MPN表，报告每g（mL）样品中大肠杆菌MPN值。大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别注：如果是出现了这个表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应该重新划线分离，必要时需要重复试验。靛基质(I)甲基红(M)VP试验(Vi)枸橼酸盐(C)鉴定(型别)＋－＋＋－－－－典型大肠杆菌非典型大肠杆菌＋－＋＋－－＋＋典型中间型非典型中间型－＋－－＋＋＋＋非典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌EMB琼脂主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美监。原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝

5、结合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。不发酵乳糖产酸的细菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。EMB琼脂上大肠杆菌的典型菌与可疑菌落典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心生化鉴定的注意要点靛基质试验：36℃±1℃，24h±2h；甲基红试验：36℃±1℃，4d；滴加甲基红试剂，出现红色为阳性；出现黄色为阴性结果。V-P试验：36℃±1℃，48h±2h；滴加试剂后若未出现伊红色，应再培养2h后再

6、观察结果。柠檬酸盐试验：36℃±1℃，96h±2h；观察有无细菌生长。有细菌生长培养基可变为蓝色。第二法VRBA-MUG平板计数法制订依据美国食品药品管理局（FDA）：BacteriologicalAnalyticalManual，2002，Chapter4：EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria基本原理4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，英文缩写MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠杆菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠

7、杆菌阳性。MUG对大肠杆菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。VRBA-MUG平板计数法检验程序检样25g(ml)+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA-MUG平板紫外光下，计数发荧光的菌落报告结果36℃±1℃18~24h检验选取2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1mL注入两个无菌平皿。另取1mL样品稀释液注入一无菌平皿中，