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1、高级生物化学与分子生物学综合实验报告一、实验目的以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。二、实验原理利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。三、实验内容一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化实验1.重组质粒的分
2、离、纯化及检测实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收实验3.感受态细胞的制备、连接与转化二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达实验4.细菌的大量培养及重组蛋白的诱导三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化实验6.目标蛋白的SDS-PAGE鉴定实验1质粒DNA的分离、纯化及检测材料、设备及试剂一、材料转化的细菌，1.5ml塑料离心管,离心管架。二、设备微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温
3、水浴锅等。三、试剂1.LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeastextract)2.5g，NaCl5g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积500mL，高压下蒸气灭菌20分钟。2.LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。3.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备。4.质粒提取试剂盒。4.操作步骤1.细菌的培养和收集将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到
4、2-5mlLB液体培养基(含50μg/mlAmp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。2.取液体培养物1.2mL于Eppendorf管中，然后6000g/min离心2min，弃上清。3.质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。4.-20℃保存DNA以备电泳检测。实验2质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收材料、设备及试剂一、材料质粒；HindⅢ酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose)二、设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪。三、试剂50×TAE电泳缓冲液；6×电泳载样缓冲
5、液。操作步骤一、DNA酶切反应1.反应体系组成：10XBuffer5μLHindIIIPlasmid1μL20μLH2O24μL2.混匀反应体系后，将eppendorf管置于泡沫板上，37℃水浴保温1小时，使酶切反应完全。3.停止反应，置于冰箱中保存备用。二、琼脂糖凝胶电泳1.取50×TAE缓冲液4ml加水至200ml，配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。2.胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml1×TAE稀释缓冲液，轻轻摇匀，溶胀30min，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。3.胶板的制备：将有
6、机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。4.加样：取10μl酶解液与2μl6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。5.1.电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。2.染色观察和拍照。3.回收条带，用回收试剂盒。步骤参见试剂盒说明书。实验3感受态细胞的制备、连接与转化材料、设备及试剂一、材料E.coliBL21/DE3菌株:Amp-；无菌eppendorf管。
7、二、试剂LB液体培养基、T4DNA连接酶、氨苄青霉素、含Amp的LB固体培养基操作步骤一、连接反应1.取新的经灭菌处理的1.5mleppendorf管,编号。2.体系组成：共10μlBuffer1X回收的DNA片段100ngT4DNAligase1μL去离子水1.顺序：去离子水、回收的DNA片段、回收的DNA片段、T4DNAligase。2.混匀后用小离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24h。二、E.coli感受态细胞转化三、1.从4℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，立即置冰上。四、2.加入连接产物溶液(体积不超过
8、10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。3.42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4.向管中加入0.8mlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃低转速振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5.将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含
