SOP-819-02微生物限度检查操作程序.doc

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1、微生物限度检查操作方法1实验前准备1.1实验用物品1.1.1对照用菌液大肠埃希菌【CMCC（B）44102】以上标准菌株由中检所提供。取相应菌株营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种于营养琼脂培养基内，培养18-20小时后，稀释至1：106。1.1.2稀释水、刻度吸管、平皿稀释水：生理盐水瓶装，塞上胶塞，按高压蒸气灭菌操作程序，121℃湿热灭菌30分钟。取0.2ml、1ml、5ml、10ml刻度吸管、平皿置于金属容器中，140℃干热灭菌2小时。1.1.3培养基准备：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基、胆盐乳糖培养基。以上实验所需干粉培养基均由中检所提

2、供，分别按说明加适量水加热溶解后，塞上胶塞，湿热灭菌30分钟备用。1.1.4无菌衣将无菌衣、头罩、口罩、乳胶手套叠好，置于无菌衣袋中，湿热灭菌30分钟。1.2无菌室及操作台的准备用0.1%的新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液将操作台，天花板，墙壁，地面擦洗一遍，同时将操作台用0.1%新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液擦洗一遍。将实验所需物品通过传递窗移入无菌室，打开空气净化系统，打开紫外灯，杀菌0.5-1个小时。2实验操作2.1进入无菌室更衣间，用0.1%新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液消毒手及腕部至少一分钟，戴上头罩、口罩，穿好无菌衣及无菌手套后，进入无菌室，开始实验操作。2.2供试液的制备2.2.1液体

3、供试品2.2.1.1取供试品10ml，加PH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml（必要时可啬稀释液），浸泡、振摇，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2.2.2固体、半固体或黏稠性供试品2.2.2.1取供试品10g，加PH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解混匀，作为1：10的供试液。2.2.3膜剂供试品2.2.3.1取供试品100cm2，剪碎，加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡1分钟，振摇，作为1：10的供试液。2.2.4包装用复合膜供试品2.2.

4、4.1用开孔面积为20cm2的消毒过的金属模板压在试样的内表面上，将无菌棉签用无菌生理盐水稍沾湿，在板孔范围内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，每个位置用2支棉签共擦抹10次。共擦抹5个位置100cm2。每支棉签擦抹完后立即剪断（或烧断），投入盛有30ml无菌生理水的三角烧瓶（或大试管）中。全部擦抹棉签均投入瓶中后，将瓶迅速摇晃1min，静置10min即得1：10供试液。2.3细菌、霉菌及酵母菌计数2.3.1平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：101、1：102、1：103等适宜的稀释度。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15-

5、20ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度至少制备2个平板。2.3.1.1细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。2.3.2阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。2.3.3菌落计数2.3.3.1细菌培养时间为48小时，分别在24及48小时点计数落数，一般以48小时菌落数为准。霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。2.3.3.2营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，玫瑰红钠琼脂平板一般点计霉菌菌落数。

6、在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。2.3.3.3菌数报告规则2.3.3.3.1宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间，霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。2.3.3.3.1.1当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。2.3.3.3.1.2当同时有2个稀释级的菌数符合上述规定时,视两者比值（高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于

7、2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；当比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。2.3.3.3.1.3当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。2.3.3.3.1.4如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低