北医分子生物学复习思考题.doc

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1、一、如何设计DNA序列的引物（尤其为方向）（1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低，过长时则成本增加，且也会降低特异性。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45~55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时进行辅助检索分析。（5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发效率

2、存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而不选A.(6)引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制，只要与模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不与模板DNA匹配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造成突变。二、如何提高PCR扩增特异性1.递减PCR（TouchDownPCR）递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm

3、高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续在扩增中占据优势。2.热启动（1）热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。（尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪

4、达到变性温度。包括延缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。）热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。（2）抗体的应用。PlatinumDNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。PlatinumTaqDNA聚合酶的成分为复合有抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体的重组TaqDNA聚合酶。抗体在PCR配制，以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。TaqDN

5、A聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的TaqDNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaqDNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的TaqDNA聚合酶活性。（将与TaqDNA聚合酶特异性结合的抗体加入反应溶液中，抗体与TaqDNA聚合酶结合，使TaqDNA聚合酶不具有活性。当反应体系加热时，抗体与TaqDNA聚合酶分开，从而使TaqDNA聚合酶发挥作用。PCR反应开始进行。）3.促进PCR的添加剂退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板

6、进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量，长DNA的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRxEnhancerSolution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRxSolution还有其他优点。在同PlatinumTaqDNA聚合酶和PlatinumPfxDNA聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得

7、最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制TaqDNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。4.巢式PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套