MSC防止污染的处理方法.docx

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1、MSC防止污染的处理方法间充质干细胞培养时一旦发生污染很容易导致培养的细胞被破坏，因而尽量保证在培养时及早预防污染的发生，如果发生污染需要重新复苏或者重购细胞再次进行培养，如果是发生较大价值的细胞被污染很难再次获得细胞时，可以采用培养液5~10倍常用抗生素冲击，在抗生素作用24~48小时之后，重新换入常规的间充质干细胞培养液有可能会出现效果。常用于细胞培养的抗生素如下表：+为效应程度在间充质干细胞培养时加入高浓度的抗生素和抗菌素会对细胞本身产生一定的毒性和危害，因此在大量添加之前首先要做好剂量反应，找到合适的计量再进行大量添加，特别是在使用诸如两性霉菌素

2、这类抗生素以及泰乐菌素这类抗霉菌素时更需要注意做好上述反应控制剂量。确定毒性水平以及消除消除培养污染的具体操作步骤如下：1.将细胞稀释到传代浓度，使用没有添加抗生素的培养基来消化、计数和稀释细胞；2.将细胞悬液进行等份分装到多空培养板或几个小培养瓶中，将不同浓度的抗生素或抗菌素分别加入到每个培养孔或者小瓶中进行观察对比。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0mg/ml；3.每天观察细胞状态，如出现脱落、变圆、空泡、和汇合度下降等；4.带确定抗生素对细胞的毒性水平之后，在使用抗生素浓度低于毒性水平2~3倍的培养液培

3、养细胞2~3代；5.培养细胞1代于无抗生素培养基；6.重新进行步骤4；7.培养细胞4~6代于无抗生素培养基，检测是否还存在污染情况。间充质干细胞MSC细胞冻存方法指导如何冻存间充质干细胞是我们在培养细胞时必然会遇到的，一般我们培养出细胞后无论是实验还是临床细胞必然不可能一次性用完并且还需要保留样本，在保存细胞时就一定需要冻存。那么该如何对细胞进行冻存呢，在冻存细胞时又有哪些问题是需要注意的呢？下面就给大家来详细的介绍一下关于细胞冻存的整个步骤指导。1细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞

4、悬液以800～1000r/min离心5min，去上清液；(3)向细胞沉淀物中加入细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管0.5-1ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)在冻存管上做好标记，包括细胞名称、代次及冻存日期等内容。2冻存为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。标准的降温速度是1-2℃/min，当温度到达-25℃，降温速度可加快至5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约30min；(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～

5、-20℃），约1-2小时；(3)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；(4)最后将冻存管投入液氮中保存。降温过程也可使用专为细胞冻存设计的程序冷冻仪，我们采用的是将冻存管放入冻存盒里，再放入-80℃过夜，由于聚氯乙烯导热比较慢，所以温度可慢慢降下来，次日可直接放入液氮罐。这样可以保证细胞的活力不受到温度变化速率的影响。3在冻存时需要注意的问题：在使用DMSO前，不能进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。也不能使用普通的砜类材料的过滤膜来进行过滤。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时

6、最好带手套。冻存液最好现用现配。在将细胞冻存管投入液氮时，操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出，对皮肤造成冻伤。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，可复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。间充质干细胞MSC的老化现象及处理方法在间充

7、质干细胞培养的过程中如果没有选择好合适的培养环境或者培养前没有做好充足的准备工作就很容易出现细胞的老化现象，这是间充质干细胞培养的难点之一更是在实验中经常遇到的问题。干细胞的老化一般表现为以下现象：1.细胞老化最开始的现象通常为在细胞浆内特别是在核区附近会出现黑色颗粒；2.老化以后的细胞会出现立体感慢慢消失，开始成扁平状，细胞与细胞之间的间隔减小或混在一起，细胞不再为梭形会成为各种不规则形状；3.细胞的贴壁性减弱，开始有细胞漂浮于培养液中；4.分泌强的细胞的会出现更多的分泌物，细胞表面的纯净度越来越低；5.分裂的细胞数量明显的减少同时细胞的增值速度也会大

8、大下降。对于细胞老化的原因分析及预防和处理方法：1.接种密度不当。一些干细胞具有