克隆载体表达载体构建详细版.docx

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1、一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer10uldNTPs5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1

2、、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。1、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。2、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。3、加入xp2300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。4、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）5、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。6、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。7、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，1

3、3000r，重复3次，-20℃保存。五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix5ul回收产物1ulDD水3.2ul六、构建bluntcloning载体（克隆载体）（4ul体系）胶回收产物3.5ulBluntcloning0.5ul混匀后，PCR：25℃15min盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC培养基

4、解冻（室温解冻）。3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。4、加入900ulSOC培养基，混匀。1、37℃，160r摇床1h，使细菌复苏。2、取出后离心3000r，2min。3、吸出上清，留下100-150ul左右冻在LB100ml+kana或者A固体培养基上。4、涂板，37℃过夜培养。5、挑单菌落（一般不超过7个）加入到10ul的DD水中。菌液PCR体系（10ul体系）上游引物0.4ul下游引物0.4ulMix5ul菌液1ulDD水3.2ul之后跑电泳，若有目的

5、条带则继续。七摇菌菌液+LB液体（加抗生素）-------L管（过夜摇菌）第二天500ul菌液+500ul甘油混匀保存2管，其中一管送检，另一管-70℃保存。若检测结果正确八、提取质粒1、在1.5ul的EP管中收集菌液，10000转，1min，弃上清，重复一次。2、加205ulsolutionI（提前预热），用枪头打匀，室温静置2min。3、加250ulsolutionII（提前预热），混匀，室温静置2min。4、加350ulsolutionIII，混匀，室温静置2min（有白色丝状物产生）5、130

6、00转，10min，取700ul上清液于吸附柱中，10000转，1min。1、加500ulHBbuffer，12000转，1min，倒掉废液。2、加700ulDNAwashbuffer，13000转，1min，倒掉废液，重复一次。再空离心2min13000转。3、37℃烘箱中干燥5分钟，加50ulDD水溶解，静置2min，离心13000转，2min。九做酶切（50ul）DD水19ulK-B5ul质粒20ulbamI3ulHIndIII3ul之后37℃烘箱，不超过16h十、加5ulloddingbuff

7、er若有条带胶回收。十一胶回收（步骤同四）十二做连接，连接表达载体目的基因（胶回收的）4ul载体（1300）1ulDD水2ulBuffer2ulT4连接酶1ul过夜16℃，水浴连接。十三、连接后转化，同“六”十四、挑条单菌落跑菌落PCR，若有条带，将剩下的9ul+LB液体+K加入L管过夜培养。十五、取L管500ul与500ul甘油加入EP管中，并与-70℃保存将L管剩下的菌液取1ul跑菌落PCR（10ul体系）跑电泳检测结果。十六提质粒十七酶切检测DD水7ulK-B1ul质粒1ulBamI0.5ulH

8、inIII0.5ul37℃2.5h后可以检测。