行业标准：BJS 201715 豆制品中碱性橙2的测定.pdf

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1、附件3豆制品中碱性橙2的测定BJS2017151范围本方法规定了豆制品中碱性橙2的高效液相色谱-质谱/质谱测定方法。本方法适用于豆腐、豆干、腐竹、豆皮、油炸豆腐中碱性橙2的测定和确证。2原理o试样经水-乙酸-乙酸铵-乙腈超声萃取，提取液于-20C冷冻分层，离心去除少量脂质类杂质，酸化后以混合型阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱测定和确证，外标法定量。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1乙腈（CH3CN)：色谱纯。3.1.2甲醇（CH3OH)：色谱纯。3.1.3甲酸（HCOOH)：色

2、谱纯。3.1.4甲酸铵（HCOONH4)：色谱纯。3.1.5氯化钠（NaCl）：分析纯。3.1.6冰乙酸（CH3COOH）：分析纯。3.1.7乙酸铵(CH3COONH4)：分析纯。3.1.80.4%乙酸-20mmol/L乙酸铵水溶液：精确称取乙酸铵0.77g，移取冰乙酸2mL，用水溶解并定容至500mL。3.1.90.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵水溶液：精确称取甲酸铵0.32g，移取甲酸0.5mL，用水溶解并定容至500mL。3.2标准品碱性橙2：中文别名王金黄，英文名称Chrysoidine，CAS号:532-82-1，分子式C12H12N4·HCl，分子

3、量248.72，纯度≥95%。3.3标准溶液配制3.3.1标准储备液：准确称取适量碱性橙2标准品，用少量50%乙腈水溶解，再用乙腈定容，制成1000mg/L标准储备液，-18℃以下保存，标准储备液在12个月内稳定。3.3.2空白基质溶液：按照6.1规定的样品预处理方法操作制备。—41——3.3.3标准系列工作液：用空白基质溶液（3.3.2）将标准储备液（3.3.1）稀释成0.5µg/L、1.0µg/L、5.0µg/L、10.0µg/L、15.0µg/L作为液相-质谱/质谱标准工作液。现配现用。3.4材料3.4.1OasisMCX固相萃取小柱：60mg/3mL，或

4、性能相当者。使用前依次用3mL甲醇、3mL水进行活化。3.4.2聚四氟乙烯滤膜：0.22μm。3.4.3具塞塑料离心管：50mL、15mL。4仪器和设备4.1超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。4.2电子天平：感量为0.0001g和0.01g。4.3漩涡混合器。4.4超声波清洗器。4.5低温离心机：转速不低于5000r/min。4.6组织捣碎机。5试样制备与保存将固体样品充分粉碎混匀，试样于-18℃以下冷冻保存。6分析步骤6.1样品预处理6.1.1提取称取1g（精确到0.01g）干燥试样或2g含水试样于50mL塑料离心管内，加入2.5m

5、L0.4%乙酸-20mmol/L乙酸铵水溶液（3.1.8）混匀、加入10mL乙腈，涡旋混匀15s，超声萃取30min，静置分层，4ºC下9000r/min离心10min，取上清液于50mL离心管内。残渣中再按上述步骤复提取一次，合并上清液。6.1.2净化6.1.2.1-20°C冷冻、离心提取液中加入约0.5g氯化钠，于-20ºC冷冻2h，分层，取出后4ºC下9000r/min离心5min，上层乙腈待过固相萃取柱净化或直接用于LC-MS/MS测定。6.1.2.2过固相萃取柱取乙腈提取液（6.1.2.1）10mL，加入200μL甲酸酸化，过OasisMCX固相萃取小

6、柱（3.4.1），用5mL甲醇淋洗，然后将固相萃取柱抽干，用3mL5%氨水-甲醇溶液洗脱目标化合物，收集洗脱液，35℃氮吹浓缩至近干，用2.0mL80%乙腈-水溶液溶解，9000r/min离心5min或过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，LC-MS/MS测定。——42—6.2液相色谱-质谱/质谱仪器测定参考条件6.2.1超高效液相色谱条件a)色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18，1.7μm，2.1mm×100mm，或性能相当者；b)流动相：A为0.1%甲酸-10mmol甲酸铵水溶液（3.1.9），B为乙腈（3.1.1），梯度洗脱条件见表1；c)流速：0.3mL/

7、min；d)柱温：40°C；e)进样量：5μL。表1超高效液相色谱梯度洗脱条件时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0.090.010.05.040.060.05.110.090.07.010.090.07.190.010.09.090.010.06.2.2质谱条件a)ESI(+)离子源。b)毛细管电压：2.8kV。c)离子源温度：150°C。d)脱溶剂气温度：400°C。e)脱溶剂气流量：800L/h。f)特征离子见表2。表2碱性橙2的定性离子、定量离子、锥孔电压和碰撞能量母离子子离子锥孔电压碰撞能量化合物名称（m/z）（m/z）(V)(eV)碱性橙221

8、3.177.1*；121