蛋白质纯化技术课件.ppt

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1、蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation,PurificationandIdentificationofProtein分子生物学圣经—分子克隆实验指南为什么要纯化蛋白质？理论意义：深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白质…应用价值---蛋白质工程医药、工业、科研…作为药物靶点…蛋白质是生命功能的执行者蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能；其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料；最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品。本章概

2、要蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则纯化步骤蛋白质的鉴定一、蛋白纯化方法蛋白质纯化的根据：不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因：氨基酸的数目和序列不同。1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性①分子大小②分子形状③带电特性④溶解特性⑤与配体特异性结合不同⑥吸附性质⑦变性和复性1.1分子大小蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质肽链的数目每条肽链的氨基酸残基数目。几百~百万Da常用方法透析超滤凝胶过滤离心透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

3、超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。凝胶过滤是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。超速离心离心（centrifugation）：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。超速离心法(ultracentrifugation)：~60万g，6万~8万r/min。可用来测定蛋白质分子量。超速离心1.2分子形状形状蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受到分子形状的影响。方法梯度离心电泳1.3电荷原理蛋白质的净电荷与蛋

4、白质等电点pI以及环境pH值有关（pH>pI，－）方法电泳离子交换层析1.4溶解度原理蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法盐析法（eg.硫酸铵）有机溶剂沉淀法（eg.丙酮）等电点沉淀法蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。盐析原理：高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。盐析法1.5配体特异性结合原理生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识别其他分子并可逆结

5、合，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析1.6吸附性质原理蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。方法疏水层析1.7变性和复性原理变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。方法如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白2.分离方法在实验操作上，分为：沉淀法离心法电泳法超滤法相分配法层析法*

6、不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，*而且所用的主要技术手段都基本相同。Note二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定蛋白质纯化的前期准备关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？纯化时间长短？最终花费？纯化方

7、案？1、选择实验材料及预处理选择实验材料物种的选择组织的选择实验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液材料破碎：材料破碎机械剪碎研磨反复冻融法超声破碎法高压匀浆法酶解法2、蛋白质的提取①提取分离原则尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）选择合适的pH、选择合适的离子强度2、蛋白质的提取②提取液成分的确定pH缓冲液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,柠檬酸-柠檬酸钠…离子：动物NaCl,植物KCl还原剂:DTT…蛋白酶抑制剂：EDTA,PMSF…金属离子螯合剂

8、:EDTA,EGTA…去污剂:SDS,CHAPS,TritonX-