设计跨内含子引物的方法.docx

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1、设计跨内含子引物的方法一、为什么要设计跨内含子的引物区别或消除gDNA的扩增二、如何设计1、在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，links到geneback即可显示出该基因DNA的信息,这是基因组DNA,从mRNA选项中JION后面的是外显子的位置，为了以后的操作，可以把这个DNA序列、外显子和CDS序列的起至位置记下来。2、在pubmed上找到目标基因的mRNA序列步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页

2、面，即可显示出这个基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它记下来。注：最好能找到以NM或XM开头的序列，以此做为设计引物的模板。NCBIRefSeq(美国国立生物技术信息中心参考序列库)是目前世界上最完整和最具有权威性的人类基因组编码mRNA序列数据库。它已收集了大约17,500个经cDNA测序证实的"NM"序列，还有大约10,000个主要由计算机推测产生的"XM"序列。由于一些序列来自异常连接产生的转录物或由计算机推演产生的不正确内含子-外显子剪切，因此该数据库所收集的参考序列一直在不断地被修改中，尽管如此，NCBIRefSeq仍

3、是目前最可信赖的人类基因mRNA序列数据库。3、如何设计跨内含子的引物（利用primer5）步骤：1）、在第2步页面右边，点击realtimePCR一般产物长度为80～150bp，引物长度15~20bp，点击GETprimer。2）、会得到若干条引物，从图中信息即可看出跨内含子的引物，建议只用BLST找到跨内含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer5继续设计引物。此时，需记下跨内含子引物所在2个外显子的位置（确认是否在CDS序列内）。3）、打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Cop

4、y步骤1的CDNA序列在输入框内（选择As），[此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白]。点击Primer，进入引物窗口。4）、此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”——“Pairs”，设定搜索区域、引物长度和产物长度。搜索区域即为上一步记下的两外显子序列位置，QPCR引物长度大约为15~20bp,产物长度为80~150bp.在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可。5）、点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完

5、成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。6）、对于引物的序列，可以简单查看一下，Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不

6、存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.7）、在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。4、用PRIME

7、R5查找已知引物的在DNA序列内的产物位置，确定其是否跨内含子步骤：打开PRIMER5，将DNA序列贴入，点击primer，显示primerprimer界面，点击左上方的“S”，再点击EDITprimer，显示EDITprimer界面，在“5‘-3‘”框中贴入上一步确定的Forwardprimer，点击asis，显示序列已被贴入，点击analyze，再点击primer，显示输入的序列和已知DNA良好配对，点击OK。显示“primerprimer界面”，点击左上方的“A”，再点击EDITprimer，显示EDITprimer界面，在“3‘-5‘”框中贴

8、入已知的REVERSEprimer，点击REVERSE，显示序列已被贴入，点击analyze，再点击prim