填料的选择课件.ppt

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1、GEHealthcare凝胶基础 知识培训Resolution:dependsonefficiencyandselectivityHighefficiencyLowefficiencyHighselectivityLowerselectivityEfficiency:评估峰的宽窄高效意味着峰窄高效意味着柱子装的好高效可以弥补低选择性带来的不利Selectivity:评估峰的分开程度的高选择性意味着两个峰从基线分开假如选择性较高,低有效性可以接受(前提是峰体积增大能接受).如何选择凝胶?五大类层析方法-1.凝胶过滤(GC)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层

2、析(HIC)5.反相层析(RPC)介质的普遍性质介质-颗粒越细、大小越均匀,分辨率越高,但反压亦较高(SOURCE介质例外),HP代表细颗粒,FF代表高流速,XL代表高载量。BigBeads物理稳定性-新一代介质较坚固,能承受高流速,同时保持柱床体积和结构稳定,省却每次重新装柱,提高重复性化学稳定性-新一代介质能承受极端pH,高盐度,促溶剂和有机溶剂,利于开发分离条件和在位清洗(CIP),大大延长介质寿命和提高重复性BioProcess凝胶特别适合生产应用,特点包括:高重复性:适用于任何规模的工艺放大高物理、化学稳定性:易于清洗、消毒及再生、介质寿命特长高动力载量、流速快

3、:缩短生产周期和次数,节省凝胶用量(尤其XL介质,载量可比普通介质高达10倍!)每种凝胶均有完整的文献、档案和RegulatorySupportFile融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化蛋白质纯化策略适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量粗提粗提:离子交换填料预装柱20ml颗

4、粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSepharose™FastFlowSepharose™XL粗提:疏水层析填料HiPrep™16/10HiTrap™HIC选择试剂盒放大SepharoseFFPhenyl(苯基)Butyl(丁基)Octyl(辛基)中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP<150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURC

5、E™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S<1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基,丁基,异丙基300cm/hr小包装和预装柱回收率载量目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝胶过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度精细纯化精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™PeptideSuperdex200Superdex75分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106PrepGrade(34µm)GL(13µm)有HiLoad™预装柱和

6、小包装填料Mr100-7000Mr3000-70000Mr10000-600000Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S>25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S<2mg上样载量精细纯化:离子交换填料MiniQ和MiniS离子交换柱(3mm)高分辨Sample:dA12-dA30mixtureBufferA:10mMNaOHBufferB:10mMNaOH,2MNaClFlowrate:1.0ml/minMiniQPE4.6/50用少於15min分离12-30碱基的dA寡核酸精细纯化:疏水层析填料RESOURCE™Phenyl苯基Iso

7、propyl异丙基Ether乙醚1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm凝胶过滤介质以分子量大小作分离,大分子先走完柱子,小分子后出;不同介质有不同分离范围,须根据目标物的大小而作选择凝胶过滤种类SephadexSepharoseSephacrylSuperde

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1、GEHealthcare凝胶基础 知识培训Resolution:dependsonefficiencyandselectivityHighefficiencyLowefficiencyHighselectivityLowerselectivityEfficiency:评估峰的宽窄高效意味着峰窄高效意味着柱子装的好高效可以弥补低选择性带来的不利Selectivity:评估峰的分开程度的高选择性意味着两个峰从基线分开假如选择性较高,低有效性可以接受(前提是峰体积增大能接受).如何选择凝胶?五大类层析方法-1.凝胶过滤(GC)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层

2、析(HIC)5.反相层析(RPC)介质的普遍性质介质-颗粒越细、大小越均匀,分辨率越高,但反压亦较高(SOURCE介质例外),HP代表细颗粒,FF代表高流速,XL代表高载量。BigBeads物理稳定性-新一代介质较坚固,能承受高流速,同时保持柱床体积和结构稳定,省却每次重新装柱,提高重复性化学稳定性-新一代介质能承受极端pH,高盐度,促溶剂和有机溶剂,利于开发分离条件和在位清洗(CIP),大大延长介质寿命和提高重复性BioProcess凝胶特别适合生产应用,特点包括:高重复性:适用于任何规模的工艺放大高物理、化学稳定性:易于清洗、消毒及再生、介质寿命特长高动力载量、流速快

3、:缩短生产周期和次数,节省凝胶用量(尤其XL介质,载量可比普通介质高达10倍!)每种凝胶均有完整的文献、档案和RegulatorySupportFile融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化蛋白质纯化策略适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量粗提粗提:离子交换填料预装柱20ml颗

4、粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSepharose™FastFlowSepharose™XL粗提:疏水层析填料HiPrep™16/10HiTrap™HIC选择试剂盒放大SepharoseFFPhenyl(苯基)Butyl(丁基)Octyl(辛基)中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP<150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURC

5、E™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S<1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基,丁基,异丙基300cm/hr小包装和预装柱回收率载量目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝胶过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度精细纯化精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™PeptideSuperdex200Superdex75分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106PrepGrade(34µm)GL(13µm)有HiLoad™预装柱和

6、小包装填料Mr100-7000Mr3000-70000Mr10000-600000Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S>25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S<2mg上样载量精细纯化:离子交换填料MiniQ和MiniS离子交换柱(3mm)高分辨Sample:dA12-dA30mixtureBufferA:10mMNaOHBufferB:10mMNaOH,2MNaClFlowrate:1.0ml/minMiniQPE4.6/50用少於15min分离12-30碱基的dA寡核酸精细纯化:疏水层析填料RESOURCE™Phenyl苯基Iso

7、propyl异丙基Ether乙醚1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm凝胶过滤介质以分子量大小作分离,大分子先走完柱子,小分子后出;不同介质有不同分离范围,须根据目标物的大小而作选择凝胶过滤种类SephadexSepharoseSephacrylSuperde

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