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1、纤维素酶分离纯化方案精品文档纤维素酶的分离及纯化方案纤维毒酶已广泛应用于食品、医药、饲料和纺织等领域。纤维素酶来源广泛、组分复杂,各组分的分子量和等电点相差很小,分离纯化工作比较困难；而纤维素酶的分纯工作非常重要,只有得到纯酶,才能了解其组成、性质及相互关系,并可根据纤维素酶的不同理化性质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和ＤＮＡ体外定点诱变等提供依据。1 材料1.1 粗酶液：取菌种发酵液于4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清液即为粗酶液
2、。1.2 纤维素酶分离纯化材料与介质透析超滤材料:10,000ＮＭＷＬ透析袋;分离纯化介质:SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-501.3 主要仪器:柱层析系统；ＤＹＹ-2稳压稳流电泳仪；ＤＹＹ-ｍ24Ｄ型电泳槽；层析柱50ｃｍ×2.6cm；紫外检测仪；记录仪;分步收集器;高速冷冻离心机;全温震荡培养箱。2方法2.1纤维素酶活力测定方法:3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（
3、DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。2.2 蛋白质含量测定：采用Bradford法测定蛋白质含量,以牛血清白蛋白(ＢＳＡ)收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档做标准曲线。采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliantblue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其
4、与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(0～1000μg/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。2.3 纤维素酶的分离纯化方法2.3.1 粗酶液的制备:取发酵液于4℃,8000rpm,离心15分钟,收集上清夜即为粗酶液。测定粗酶液中纤维素酶活,蛋白质含量。2.3.2 硫酸铵沉淀和透析:取粗酶液,加入硫酸铵至25%饱和度,4℃,10000rpm,离心10分钟,分别测沉淀物和上清液中的酶活,酶活集中于沉淀物中,收集沉淀物溶于少量0.05ｍｏｌ/ＬＰｈ6.0磷酸缓冲液中,透析除盐,得到经硫
5、酸铵沉淀的纯化酶液,此为分子筛柱层析上样样品。2.3 纤维素酶的分离纯化方法2.3.3葡聚糖凝胶层析 葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-50,充分溶胀,抽气,分别装柱(50cm×2.6cm),用0.05ｍｏｌ/ＬｐＨ6.0磷酸缓冲液充分平衡后上样,选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。2.3.4 SDS-SPGE 采用垂直板式不连续系统电泳,分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,用0.25%
6、(Ｗ/Ｖ)考马斯亮蓝Ｒ-250酸性乙醇水染色。说明：¨凝胶过滤层析条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜。¨由于酶易失活，故分离纯化工作于4℃下进行，实验中用到的各溶液、器皿均应先预冷。¨加硫酸铵时要慢，同时搅拌，防止局部盐浓度过高。搅拌速度也不要太快，防止蛋白质表面变性。¨收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档装柱时，胶悬桨不要太稀也不要太稠，太稠易带入气泡，太稀则需分次才能装完。¨上样和换层析液时，要保持床面平整，同时床面不能流干。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
