生物化学第34章课件.ppt

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1、第34章DNA的复制和修复(DNAreplicationandrepair)一、DNA的复制二、DNA的损伤修复三、DNA的突变一、DNA的复制（一）DNA的半保留复制DNA复制的三种可能模式ConservativeSemiconservativedispersiveAfteronegenerationAftertwogenerationsWatson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型oldnewDNA的半保留复制原来的亲代分子第一代子分子第二代子分子DNA半保留复制的实验证明1958年，Mese

2、lson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA的实验，首先证明了DNA的半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长，经过连续培养12代，使所有的DNA分子都标记上15N。15N-DNA的密度比普通14N-DNA大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA。DNA半保留复制的实验证明这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含14N）上培养，经过一代以后，所有DNA的密度都介于15N-DNA和14N-DNA之间，说明其为14N和15N的杂合分子。两代后，14N分子和杂合分子等量出现。

3、当把杂合分子加热，使它们分开成单链再离心，可见有一半与单链15N-DNA的密度相同，另一半与单链14N-DNA的密度相同。（二）DNA复制的起点和方式DNA上能独立进行复制的单位称为复制子（replicon），每个复制子都有复制起始点，可能还有复制的终点。DNA复制起始点一般有特定的序列，DNA在复制起始点处解开双链，形成一个复制泡（也叫复制眼）。有些DNA的复制从复制起始点开始向两边复制，也有些DNA的复制从复制起始点开始向一边复制，它们分别称为双向复制和单向复制。DNA复制的方向未复制DNA单向复

4、制双向复制中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片大箭头所指为复制泡，小箭头所指为复制叉处的单链部分，注意二者在相反的链上。各种生物DNA的结构DNA有线性双链和环状双链，也有环状单链的。原核生物的染色体DNA和质粒，以及真核细胞中的线粒体和叶绿体DNA都是双链环状的，真核生物的染色体DNA是双链线性的。病毒的DNA有单链环状的，也有双链环状的，还有双链线性的。DNA上复制子的数目原核生物染色体DNA和质粒DNA就是一个复制子，从一个复制起始点开始完成整个DNA分子的复制。真核细胞一个染色体DNA上有许多

5、复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制起始点完成一段DNA的复制，然后将各个片段连接起来。复制起始点的确定大肠杆菌染色体DNA只有一个复制起始点。在一个生长的群体中几乎所有的染色体都在复制过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越多，也就是出现的频率越高。将从大肠杆菌中提取出来的DNA切成大约1%染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复制起始点oriC位于基因图谱的ilv位点处（83分附近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度向前移动。两个复制叉在离起始点18

6、0°的trp位点处（33分附近）相会合。大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定DNA的复制方式直线双向多起点双向θ型双向θ型单向DNA的复制方式D环线粒体DNA的复制采取这种方式DNA的复制方式2D环DNA的复制方式滚动环大肠杆菌的多复制叉染色体DNA酶促合成的引物链和模板链（三）DNA聚合反应有关的酶DNA聚合酶催化的聚合反应DNA聚合酶的反应特点①以4种dNTP作底物；②反应需要接受模板的指导；③反应需要有引物3’-羟基存在；④DNA链的延长方向为5’→3’；⑤产物DNA的性质与模板相同。大肠杆菌D

7、NA聚合酶大肠杆菌有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，它们有各自不同的用途。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ由一条肽链（928个氨基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量109kD。它是一个多功能酶，具有以下活性：①5’→3’聚合活性；②3’→5’外切活性（校对活性）；③5’→3’外切活性（只作用于双链DNA）；④从3’端使DNA链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反应）；⑤无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段用枯草杆菌蛋白酶裂解完

8、整的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端324～928氨基酸残基的片段，称为Klenow片段，1-323氨基酸残基为小片段。小片段具有5’→3’外切活性，Klenow片段具有聚合酶活性和3’→5’外切活性。酶切位点Klenow片段的立体结构蓝色为模板链，红色为引物链。Klenow片段的活性位点DNA聚合酶Ⅰ的校对作用在正常聚合条件下，3’→5’外切活性不能作用于生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链的3’末端核苷酸落入3’→5’外切活性位点，错