行业标准：GBT 28073-2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28073--2011南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificatiOnofarabismosaicvirus2011—12—30发布2012-06-01实施宰瞀鳃鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。刖置GB／T28073--2011本标准按照GB／Tl_1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、

2、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴嫒。1范围南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法GB／T28073--2011本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。2南芥菜花叶病毒基本信息中文名：南芥菜花叶病毒。英文名：arabismosaicvirus。异名：arabismosaicnepovirus；hopnettleheadvirus(啤酒花荨麻病

3、病毒)；rhubarbmosaicvirus(大黄花叶病毒)；raspberryyellowdwarfvirus(悬钩子黄矮病毒)；ashringandlinepatternviurs(白腊树环线状病毒)；rhabarber-mosaik-virus(大黄花叶病毒)；forsythiayellownetvirus(连翘黄网状病毒)；jasmineyellowblotchvirus(茉莉黄斑病毒)。英文缩写：ArMV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepovirus。南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。3方法原理

4、利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS_ELIsA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PcR)进行检测鉴定。4主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0．001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器(1000pL、200pL、100pL、20pL、lOlL、2pL)。5检测与鉴定5．1DAs_ELISA检测把0．5g～1．0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：1

5、0比例加入样品提取缓冲液，转移到5mL离心管中，8000r／min离心5min，上清液作为DAS_ELISA的检测提取液。设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料(如：种子或叶片)应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录B。注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。】GB／T28073--20115．2RT-PCR检测分别提取检测样品的总RNA，然后用RT-PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录c。5．3实时荧光RT-PCR检测分别提取检测

6、样品的总RNA，反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。5．4序列测定将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对，如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源性大于75％则判定为ArMV序列，小于75％则判定为非ArMV序列。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BL

7、AST／6结果判定与报告6．1结果判定当产生以下检测结果时，则判定为检出ArMV：——当DAS-ELISA检测、RT-PCR检测、实时荧光RT—PCR检测，其中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出ArMV；——当RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为ArMV序列，则判定为检出ArMV。6．2结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据报告，RT—PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT—PCR检测结果保存采集的数据，序列测定结果保存测序报告图。A．1分布附录A(资料性

8、附录)南芥菜花叶病毒简介GB／T28073—2011欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国