行业标准：GBT 25168-2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程.pdf

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1、ICS65．020．30B40雷目中华人民共和国国家标准GB／T25168—2010畜禽cDNA文库构建与保存技术规程TechnicalregulationoffarmanimalscDNAlibraryconstructionandpreservation2010-09-26发布2011-03-01实施宰瞀髁紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19GB／T25168—2010刖菁本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC／TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：马月辉

2、、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏。GB／T25168—2010畜禽eDNA文库构建与保存技术规程1范围本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语

3、和定义适用于本标准。3．1eDNAcomplementarydeoxyribonucleicacid以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的eDNA链。3．2eDNA文库eDNAlibrary将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的生化反应合成双链cDNA群体后，再插入到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的eDNA克隆群体。3．3寡核苷酸oligonueleotide一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称，常用作探针确定DNA或RNA的结构。3．4噬菌斑plaque被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体

4、，会继续感染周围的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。4试剂及溶液配制除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB／T6682一级用水的要求。4．1焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水在1000mL去离子水中加人1mLDEPC，37℃静置12h，高压灭菌(120℃30min)。4．22mol／LMgSO,称取246．50gMgS04·H20，加400mL双蒸水(doubledistilledH20，ddH20)溶解后，定容到500mL，高压灭菌。4．3TOmmol／LMgso

5、．量取1mL2mol／LMgS04加ddH20定容到200mL，高压灭菌，30rain。4．41mol／LTris-Cl(p町．5)称取121．14gTris，碱溶于800mLddH20中，调pH至7．5，定容到1L，高压灭菌。4．5SM缓冲液称取5．80gNaCI、2．00gMgS04·7H20，量取50mL1mol／LTris—CI(pH7．5)和5mL2％(质1GB／T25168—2010量浓度)明胶，定容到1L，高压灭菌。4．65x一链缓冲液250mmol／LTris(pH8．3)，30mmol／LMgCl2，375mmol／LKCl。4．710

6、xDNA连接酶缓冲液500mmol／LTris—C1(pH7．8)，100mmol／LMgCl2，100mmol／L二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，0．5mg／mL牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)。4．8LB液体培养基取10．00gNaCl、10．00g细菌培养用胰蛋白胨和5．00g细菌培养用酵母提取物加1LddHzO溶解后，高压灭菌。4．9LB固体培养基取10．00gNaCl、10．00g细菌培养用胰蛋白胨、5．00g细菌培养用酵母提取物和20．00g细菌培养用琼脂加1LddHzO溶解后，高压灭菌。4．1

7、0LB顶层培养基将0．70g琼脂糖加入100mLLB液体培养基中，高压灭菌。4．1120％麦芽糖取20．00g麦芽糖溶于100mLddHz0中，过滤除菌。5主要仪器、设备水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、一80℃低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。6cDNA文库构建6．1样品采集畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm3大小的组织碎块后放人RNA保存液中。6．2总RNA提取使用TRIzol法提取畜禽组织的总RNA。在不断填充液氮的研钵

8、中将30mg～i00mg的组织样品磨碎，加入1mLTrizol(含有酚、异硫氰酸