彗星分析系统.doc

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1、彗星分析系统单细胞凝胶电泳技术已广泛应用于单细胞DNA损伤的检测。实验原理:在于损伤的DNA在电场中从核内溢出，形成与细胞核“关部”相区别的“尾部”。目前主要用开头指标、距离指标,强度指标、“矩”类指标等四类指标分析实验结果。各种因素诱发细胞DNA损伤后会影响DNA的高级结构，使其超螺旅松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解、DNA解链等过程后，电泳时，损伤的DNA从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA部分保持球形，二者共同形成“慧星”。在一定范围内，“慧星”的长度（代表DNA迁移距离）和经荧光染色后“慧星”荧光

2、强度（代表DNA的量）与DNA损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA损伤.单细胞凝胶电泳已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法样品制作方法:取磨砂载玻片，在其毛面铺1.0%正常融点琼脂糖1ml,室温凝固后刮去;接着铺第一层0.5％正常融点琼脂糖80μl,立即加盖玻片(24.00mm×50.00mm×0.17mm)一张,在4℃温度中凝固5min；小心取下盖玻片,再铺第二层含待测细胞的低融点琼脂糖75μl(10μl细胞悬液与65μl0.7％低融点琼脂糖在37℃温度下混合),加盖玻片,在4℃温度下凝固10min；取

3、下盖玻片,在第二层胶上再铺0.7％低融点琼脂糖75μl加盖玻片，在4℃温度下凝固10min(所有琼脂糖均用无Ca2+、Mg2+的PBS配制,操作过程中应尽量避免产生气泡)。去除盖玻片，浸于新鲜配制的冷裂解液(NaCl14.61g、Na2-EDTA3.72g、Tris0.12g、肌氨酸钠1.00g、NaOH1.30g，加蒸馏水定容至89ml，临用前加Tritonx-1001ml，二甲基亚砜10ml，置4℃温度中备用)中至少1h。取出玻片控干，置于水平电泳槽中，玻片间不留空隙，槽内加电泳液(NaOH42g、Na2-EDTA1.302g

4、，加蒸馏水3500ml)至液面高出玻片0.2cm,静置20min,然后在25V电压条件下通过升降电泳液面将电流调至300mA,电泳20min。取出玻片,用中性化液(pH7.5、0.4mol/LTris-HCl缓冲液)轻轻滴洗玻片凝胶5次，每次1min。控干玻片，每张加100μl溴乙锭(2×103μg/L)染色液，加盖玻片在4℃温度下染色30min，最后在荧光显微镜下观察，计数200个细胞.系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究

5、，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等软件功能测量参数包括:HeadRadius(头部半径):彗星头部半径TailLength(尾长):即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“彗星”电泳方向上的最大长度IntegralIntensity:积分光密度HeadDNA%:头部DNA含量TailDNA%:尾部DNA含量TailMoment:尾部力矩OliveMoment(Olive力矩):定义为尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积典型的“彗星”几种“彗星”图